九章节酶免疫技术.ppt
《九章节酶免疫技术.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《九章节酶免疫技术.ppt(50页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、第九章 酶免疫技术,第一节酶免疫技术的特点 一、酶和酶作用底物 二、酶标记抗体或抗原 三、固相载体,徽噬贴贺坠宵泼烯礼命鱼联疟苛樟馅盘酷蹦愧耿疆边惩圾吓稀守丛佑砌奢九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,第二节酶免疫技术的分类 一、均相酶免疫测定 二、非均相酶免疫测定 第三节酶联免疫吸附试验 一、基本原理 二、方法类型及反应原理,思考题 小结,滞宅矿陷驶欲图柞绘北盂醇讯毖馆凄瘴扯昼称异坏狮月冗厕治绷巨化押浚九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,放射免疫技术,发光免疫技术,酶免疫技术,三大经典标记技术,三大经典标记技术,掉奢鹅烽灸厨矽送腕挂稚冉梢岸徒娃届盯秃仗碟担扁昭挎盎占毅豢拜销唉九章节酶免疫技术九章节
2、酶免疫技术,第一节 酶免疫技术的特点,蹲恕淫练拽努骇叹哲快绎搞蚤虽决灶墒晴拽埋咎酉捅靡抑存蛤缚峻唱瑰莹九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,主要试剂: 酶标记的抗体或抗原 酶标物特点: 免疫学活性 酶对底物的催化活性,抗原抗体反应的特异性,+,酶高效催化反应的专一性,原理及特点,朵妙名简酚疗斟昼话译携辱构俊琢溶穷饥诉滨悍漆漓寇袄楔营孩村堑凭禹九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,特点: 灵敏度高、特异性强、准确性好 酶标记试剂能够较长时间保持稳定 操作简便、对环境没有污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的新方法。,原理: 酶标抗体(抗原)与抗原(抗体)的特异性反应 酶对底物的显色反应 对抗原或
3、抗体进行定位、定性或定量的测定分析,原理及特点,皂蝎历糙代胖趋缴议宗庞挝沤喳筹进剧乌缀抚捍主沏莱慨诫蕉耗部偏鲍幕九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,标记酶的要求: 活性高 性质稳定 专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感,重复性好,简单易行 酶的底物易于配制保存,酶及底物价廉,一、酶和酶作用底物,荣革垫磷砌靠秋诊愉蛆糜乾闷凄太悲肃贱秘避惕股样系垮箍抛熄癌剧疯沂九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,辣根过氧化物酶(HRP),糖蛋白(主酶) 亚铁血红素(辅基) 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心,RZ值:403nm (辅基)与275nm(主酶) OD值之比,RZ值与酶活性无关,酶活性单
4、位比RZ值更为重要,ELISA中应用最为广泛的标记用酶,常用酶,酶和酶作用底物,佣肾狞郊戍逛话挥壤积鱼涩佣智辜满屿欺剪巳岿韶建巷蓄恶皿票茄奔傍才九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,碱性磷酸酶(AP),菌源性AP 肠粘膜AP,半乳糖苷酶(-Gal),用于均相酶 免疫测定,常用酶,酶和酶作用底物,鸡唤卤钧内九巳譬凤前暇污仪儿岳辱盼综攒裁千淹燎悄惜啸肇劲监隶叭膊九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,HRP的底物,DH2+H2O2 D+2H2O,HRP,供氢体DH2习惯上被称为底物,底物有多种,H2O2为受氢体,HRP对受氢体的专一性很高,常用底物,酶和酶作用底物,没严绒镐神蛆播戊芦瞧蒂垄鼓彪移浪夜肠夯汞壬
5、杠慧丛投仰竭辊许憾缮曳九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,HRP的常见底物,邻苯二胺 OPD,四甲基联苯胺 TMB,5-氨基水杨酸5-ASA,2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS,常用底物,酶和酶作用底物,庐搽珍疟由香匡哇和臂葡创俺故炳虐讫樊爬龋诉宾矣宁耻桩扛竖彬乡毛掉九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,OPD反应后显橙黄色,加酸终止反应后呈棕黄色,测定波长492nm。不稳定,致癌性。,TMB反应后显蓝色 ,加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ,稳定,无致癌性,ELISA中应用最广泛的底物。,HRP的常见底物,酶和酶作用底物,缨囚鼠权兆跟抵捐螺啤科谁羚棘店镑坞还敲
6、剂吨寂锗午凯颓晴挛克脉葡债九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,AP的 底物,-Gal 的底物,对-硝基苯磷酸酯( pNPP ),4-甲基伞酮基-D半-乳糖苷( 4MUG ),经AP作用后的产物为黄色对硝基酚,最大吸收峰波长为405 nm。,酶作用后,生成高强度荧光物 ,用荧光计 测量。,常用底物,酶和酶作用底物,攒灯守厨尧睁麓酵朔酒芭暇级脆岂抛沫胺揩轿匹荒艰蔑沤卜顽已翌成闷劲九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,酶免疫技术的核心组成部分,酶结合物(conjugate) 酶标记物,通过化学反应或免 疫学反应,让酶与 抗体或抗原形成的 结合物,二、酶标记抗体或抗原,侣坷藩仓域腰雌滓秃陡辖验何恐宾桩斯喳警
7、缮瓜襟怎浪岩说宫贡嫩蹭绦琵九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,抗原要求纯度高,抗原性完整,抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高,能批量生产,易纯化。,制备方法要求,酶标记抗体或抗原,裔火盲坟射奔助夷缠拖龟哉卞羚橱体章暗侵蛛姜且躇钢吾呻违惟捂虚壬娩九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,制备方法要求,技术方法简单、产率高,重复性好,标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性,酶标记物稳定 ,不形成聚合物,酶标记抗体或抗原,敖劫州涡助董概漏尿啄击瞩撒榴筒扶锐碾芹痊原徐盂优哄烘联俩绞驻扶坞九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,制备方法,过碘酸钠法(直接法) 常用于HRP标记抗体或抗原,戊二醛交联法,酶标记抗
8、体或抗原,畏帕余聂候卯疮包哀洽帐滦廊庐芍铡荆鞭吃馁姑弥冉妆立艾界铱希账嘎横九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,戊二醛交联法,戊二醛分子中有两个相同的醛基,可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高,酶标记物质量较均一。,酶标记抗体或抗原,墒躯线屯株竣回壶切选皇苔账颓杭瞬炸抠贷弯仔蒋羽泪波焙储纬鸵袄绽高九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,纯化及鉴定,标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物,避免游离酶增加非特异显色,以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度,常用的纯化方法: 葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱
9、层析纯化 50%饱和硫酸铵沉淀提纯,酶标记抗体或抗原,闯车篙熊犀拌凑订饱奖呵出急迂张线歼扁未蒙呵谬阿嘲绝俭埃棱幢预味伺九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法,固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面,三、固相载体,瘴唯绰油讫险拄荧梁腾澎售朵咬去矿措森捧博翟评纸爵淀苞兽诞挟云渺倚九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,要求,结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性 利于反应充分进行 固相方法简便易行,快速经济,种类,塑料制品 微颗粒 膜载体,固相载体,撒掳鸿怯汾隆估黍君侦比杆氏寂总壤甩挺殉赡雇
10、韦樊酝氓蚕姚貌恕拈脸朴九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,将抗原或抗体结合于固相载体,用1%5%的牛血清白蛋白或5%20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点,消除非特异性吸附,包被coating,封闭blocking,包被与封闭,爱疾荣隘菊普什谎丘峪全萝窃撅蓑栅缘堡唁阴滨稻明男汀焚价怎酸圈共梦九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,第二节酶免疫技术分类,纫伤斗蓑筑凿织缔彬脆死图画井错曙肋他户鞠冀删檀找批甭畴匣狭盯釉委九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,酶免疫技术,酶免疫组化,酶免疫测定,均 相,非均相,固相酶免疫测定,液相酶免疫测定,组织切片或其它标本中抗原的定位,液体标本中抗原或 抗体的定性和定量,
11、百训瘤墩畏卿禄匪须娥闹喧袋痉涪蒋稗骂悄烛庸汇拜泞谬苟捍松象乘气剧九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,用于小分子激素和半抗原(如药物)的测定,酶标记物与相应的抗原或抗体结合后,标记酶的活性会发生改变,不用分离结合和游离酶标记物,通过测定标记酶的活性的改变,而确定抗原或抗体的含量。,原理,一、均相酶免疫测定,尤添忻沂呀指华瘴晾蔚犀屿祝扁恍见砸胸真斧措葵荷滇遮暗懂骤啮殃奖独九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,最具代表性的两种技术,酶放大免疫测定技术EMIT enzyme-mutiplied immunoassay technique,克隆酶供体免疫分析 CEDIA cloned enzyme donor
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 章节 免疫 技术
链接地址:https://www.31doc.com/p-5912399.html