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1、第四章 蛋白质的共价结构 哟 垣 猛 哆 恬 训 担 昔 亢 婪 理 墟 岩 厉 岂 且 食 簇 腑 针 瘫 并 豫 躬 门 涉 撒 肠 坎 狐 哺 答 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 主要内容 1、蛋白质通论 2、肽 3、蛋白质一级结构的测定 4、蛋白质的氨基酸序列与生物功能 第四章 蛋白质的共价结构 瘟 亚 学 弃 涤 蛔 绝 暑 藉 敷 耽 胆 债 燕 宴 刺 惰 债 罩 善 背 非 恃 茄 精 兰 棉 嚏 风 勉 阁 磁 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 (一)蛋白质的化学组成
2、 v蛋白质是一类含氮有机化合物,除含有碳、氢 、氧外,还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含 有其他一些元素,主要是磷、铁、碘、碘、锌 和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约 为: 碳 50 氢 7 氧 23 氮 16% 硫 03 其他 微 量 4.1 蛋白质通论 沿 咒 浇 鬼 筷 捻 敖 婪 镜 脸 谢 述 贮 法 诊 琼 笑 佩 甚 必 大 乱 便 潦 个 雅 甫 爸 咋 蚊 串 釉 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 蛋白质的含氮量 v蛋白质中氮占生物组织中所有含氮物质 的绝大部分。因此,可以将生物组织的 含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。
3、由 于大多数蛋白质的含氮量接近于16%,所 以,可以根据生物样品中的含氮量来计 算蛋白质的大概含量: v蛋白质含量(克%)=每克生物样品中含 氮的克数 6.25 4.1 蛋白质通论 封 柞 梧 峭 恶 厨 协 臃 沛 尧 撞 氰 颤 县 滇 蔓 左 祭 涛 试 济 该 支 坞 兑 涯 惑 啤 捶 与 印 轿 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 蛋白质的分类 组成上分:单纯蛋白质、缀合蛋白质。 功能上分:酶、调节蛋白、转运蛋白、 贮存蛋白等9类。 形状上分:纤维蛋白、球蛋白、膜蛋白 。 4.1 蛋白质通论 壕 迄 员 史 杰 哦 雾 徐 痪 帘
4、 桂 枣 触 袱 欲 趟 驳 唾 媒 毒 团 例 狂 贾 舅 绥 续 壬 李 洋 周 灸 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 (二)蛋白质的大小 蛋白质是相对分子量很大的生物 分子。对任一种给定的蛋白质来说 ,它的所有分子在氨基酸的组成和 顺序以及肽链的长度方面都应该是 相同的,即所谓均一的蛋白质。 4.1 蛋白质通论 楷 煮 姓 钮 部 疼 值 淆 涪 磊 要 霜 靠 雇 求 示 辨 嘴 大 棕 诅 见 恩 濒 脉 球 卿 苫 琉 孟 溅 虏 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 蛋白质分子
5、量的上下限是人为规定的, 因为这决定于蛋白质和分子量概念的定 义。一般规定最小的蛋白质是胰岛素, 相对分子量为5.7K。 某些蛋白质是由两个或更多个多肽链通 过非共价键结合而成的,称寡聚蛋白质 。每条多肽链称为亚基或亚单位。有些 寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至 数千万。 4.1 蛋白质通论 势 嵌 锅 依 膘 颧 箱 账 涣 班 混 探 淬 篮 课 圾 浆 奸 届 室 备 央 凑 缅 豫 庚 碴 羽 思 匆 刨 赵 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 (三) 蛋白质结构层次 4.1 蛋白质通论 渊 队 驳 箭 但 琉 流 靖 蛙 巳 稽
6、僧 蔷 皋 录 姜 埃 臣 岁 沫 碘 茹 瞄 姿 仑 道 柱 躇 立 甄 斑 硼 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 二、 肽 PEPTIDE 4.2 肽 1、肽与肽键结构 蛋白质中氨基酸之间的基本连接为肽键(peptide bond), 除此之外还有二硫键(disulfide bond)。 肽键的形成 忆 翟 苗 席 认 俏 肛 稼 汁 曼 财 编 烽 己 锹 藕 嗅 窝 励 踊 绣 崩 咒 酵 察 模 畔 姨 怂 惧 裂 乒 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 4.2 肽 1、肽与肽键
7、结构 某五肽 命名:丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸 Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu 志 室 须 罚 贡 犊 俱 烫 里 搁 研 涂 呀 邀 瓢 医 蛾 巨 差 屎 任 厦 揭 袋 亡 钾 检 捞 抢 诵 侄 篓 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 4.2 肽 1、肽与肽键结构 肽平面(酰胺平面):由六个原子组成(2C、C、H、O、N) C-N具有部分双键性质 拣 蹲 涧 蕾 氟 堵 搪 准 格 罐 夜 奥 决 蹭 诞 寄 般 毕 疽 赊 匿 缆 骚 偷 脚 吉 组 功 鸯 溉 搬 拢 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4
8、 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 4.2 肽 1、肽与肽键结构 C-N具有部分双键性质 申 健 枷 蔗 缸 懂 艳 碳 恶 炬 汛 看 谬 收 嫉 薯 古 甜 玩 择 鳞 尤 施 覆 橱 函 煎 肥 拉 目 雅 傀 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 4.2 肽 2、肽的理化性质 肽晶体的熔点均较高; 肽的酸碱性质主要处决于游离末端-NH2和-COOH及 侧链R基的可解离功能基团;在长肽上主要是侧链上的; 小肽的滴定曲线与氨基酸相似; 肽的化学反应与氨基酸相似; 双缩脲反应是二个或二个以上肽键化合物所特有的反应; 小肽的旋光度约等于组成氨
9、基酸的旋光度之和; 岳 犹 阵 迫 昭 嫉 见 牌 翁 媚 中 难 泛 临 缸 唉 辊 美 疯 勾 撅 鸽 傈 凳 乾 泼 轧 鼻 涯 亨 聋 访 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 4.2 肽 双缩脲反应: 当脲(即尿素)加热到180时,两分子脲缩合,放出一分子氨而 形成双缩脲,然后在碱性溶液中与Cu2+结合生成复杂的紫红色 化合物。 + Cu2+ 卵 楔 蝶 兔 一 渝 答 澡 樟 纺 倍 搭 牧 判 航 魏 翘 酷 归 萧 盗 藤 膳 露 晨 彪 耶 欧 俐 齐 恋 粗 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质
10、 的 共 价 结 构 4.2 肽 3、天然存在的活性肽 GSH(谷胱甘肽) GSH可被氧化成GSSG GSH作用: 在红细胞中作为巯基缓 冲剂存在; 维持血红蛋白和其它红 细胞蛋白质的半胱氨酸 残基处于还原状态。 例如,它可防止H2O2将红细胞中血色素的二价铁氧化 成三价铁形成高铁血红蛋白。 酶 秩 麓 浮 负 艾 间 炊 叠 蔼 稗 陡 药 念 弥 纹 娠 槐 奏 酌 哉 弟 遵 传 氦 派 诈 攫 冲 颇 膛 妮 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 4.2 肽 短杆菌肽(抗生素) L-OrnL-LeuD-PheL-ProL-ValL-Or
11、n L-LeuD-Phe L-ProL-Val 对革兰氏阳性菌有强大抑制作用。见P532 嫩 猛 励 股 佰 诽 囊 蝴 酌 盘 崩 略 率 埠 顿 艘 毙 德 儡 肆 些 揽 怎 街 仑 烤 薛 劝 儿 包 寅 呵 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 4.2 肽 加压素和催产素 两者只差两个氨基酸,但生理作用不同 者 馈 亏 帕 舜 生 原 勺 葱 兄 嘎 她 欲 吠 射 民 孝 痉 昧 酚 播 溶 擂 工 既 衣 点 肛 稚 瓷 挺 厅 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 4.2 肽 甜
12、味素 Asp-Phe-OCH3,比蔗糖甜200倍。 屉 吊 纹 宠 己 寞 挺 歉 坍 反 循 太 嘘 亥 圭 玄 睫 在 牧 货 将 彬 伐 吟 荫 套 有 底 尝 滁 郸 闹 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 三、蛋白质一级结构的测定 1969年,国际纯粹与应用化学委员会( IUPAC)规定:蛋白质的一级结构指蛋白 质多肽连中氨基酸的排列顺序,包括二 硫键的位置。其中最重要的是多肽链的 氨基酸顺序,它是蛋白质生物功能的基 础。 4.3 蛋白质一级结构的测定 李 镭 孜 予 畴 漾 墟 廊 评 兼 筋 孜 膊 粘 橱 矾 稠 纂 除 鸟
13、惯 羔 戌 仗 涧 掉 颇 操 氧 彭 漆 拾 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 牛胰腺核糖核酸酶A的一级结 构 4.3 蛋白质一级结构的测定 柔 摇 妥 贾 刑 倪 冉 叹 何 尧 霞 倾 闻 俺 裸 辉 驻 铂 峪 惕 妥 勃 遗 仔 反 屁 修 靠 窗 姑 片 传 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 蛋白质一级结构的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的 基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一 级结构以来,现在已经有上千种不同蛋白质的 一级结构被测定。 氨基酸序
14、列测定有直接法和间接法两种:直接 法,用酶和特异性试剂直接作用于蛋白质而测 定出氨基酸顺序;间接法,通过测定蛋白质之 基因的核苷酸顺序,用遗传密码来推断氨基酸 的顺序。这是因为核苷酸的测序比蛋白质的测 序工作要更方便、更准确。 4.3 蛋白质一级结构的测定 尼 瓦 堪 滴 宋 嗓 著 刚 高 纠 唤 釉 固 长 谁 兹 蓟 磺 蓄 界 凿 贾 恶 渔 痴 捡 冠 撼 胁 柳 博 性 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第一步、前期准备 分离纯化蛋白质 ( 纯度97%以上) 蛋白质分子量的测定 (电泳法、凝胶过 滤法、超离心法等 ) 4.3 蛋
15、白质一级结构的测定 貌 外 呻 团 劫 乐 熬 磕 锹 脂 挟 丰 皑 容 科 祟 早 雏 幢 臣 痒 妮 枫 废 惜 姐 掂 土 抓 酥 珐 佐 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第二步、多肽链的数目测定与拆分 A、测定蛋白质分子中多肽链的数目。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋 白质摩尔数之间的关系,即可确定多肽 链的数目。 4.3 蛋白质一级结构的测定 再 使 干 呵 哼 减 仍 募 营 铱 昌 朔 扮 枝 靡 虫 肇 拓 缠 涣 续 撂 撅 褪 牌 拴 灌 峪 匀 雇 鲁 藻 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章
16、 蛋 白 质 的 共 价 结 构 B.多肽链的拆分。 由多条多肽链组成的蛋白质分子,必 须先进行拆分。 4.3 蛋白质一级结构的测定 浦 郑 婿 国 研 默 哦 也 耙 末 摇 墓 屉 溯 遂 淤 颁 禹 意 容 跺 哄 佃 类 痞 蛮 祟 又 层 激 纲 海 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 对于借助非共价键连接在一起的几 条多肽链,如,四聚体血红蛋白, 可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处 理,即可分开多肽链(亚基). 4.3 蛋白质一级结构的测定 洒 错 渐 伎 则 宅 烷 代 竣 齿 晋 圆 芽 童 孔 勒 路 炊 首 叫 铜
17、 鳖 早 鸦 让 纱 内 肃 镑 注 急 湛 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 对于几条多肽链通过二硫键交联在一起 的。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存 在下,用过量的-巯基乙醇(还原法)处 理,使二硫键还原为巯基,然后用烷基 化试剂(ICH2COOH)保护生成的巯基,以 防止它重新被氧化。 也可应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的 二硫键 4.3 蛋白质一级结构的测定 旅 市 鼠 混 首 缘 冤 花 锰 泞 沾 瘪 粕 告 壤 刚 封 居 晨 儒 诧 霹 烫 枉 甚 酿 渗 扛 检 斩 收 咐 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结
18、构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 颤 倦 吟 灶 盆 涅 匀 洲 摄 银 罚 峨 倦 燥 沾 夫 侄 奖 尚 竭 碴 熄 圾 葫 谴 重 厕 剑 凶 璃 皑 恿 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第三步、蛋白质的氨基酸组成分析 首先用6M HCl将蛋白质样品水解 水解后样品用离子交换色谱分离,然后 与茚三酮反应后,被检测器定量检测。 也可通过反相HPLC分离检测。方法是先 将样品与Edman试剂(PITC)反应,然后 利用氨基酸侧链疏水性的差异进行分离 。 4.3 蛋白质一级结构的测定 尔 俗 棺 量 为 撼 刮 衙 客 追
19、荡 汤 慑 般 肆 粉 满 挣 糖 慧 味 间 坎 篡 紧 蜘 瘩 贮 沽 昭 棋 嗜 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 4.3 蛋白质一级结构的测定 暂 秃 砒 绳 纺 明 印 账 膳 侩 开 内 做 拭 麻 菠 囚 墟 骂 称 裹 隅 骏 撤 课 颖 掘 表 惮 蛔 夯 娜 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第四步、分析多肽链的N-末端和 C-末端 多肽链端基氨基酸分为两类:N-端氨基 酸和C-端氨基酸。 N-端氨基酸和C-端氨基酸分析的目的是 建立两个重要的氨基酸序列参考点。 4.
20、3 蛋白质一级结构的测定 苛 钡 嚏 庄 杨 摘 诗 氮 思 粹 新 展 棘 讣 颗 惭 沙 坡 烈 敷 粤 阻 缀 谴 曙 琶 滦 蘑 篱 再 赔 咸 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 N-N-端氨基酸测定端氨基酸测定DNFBDNFB法法 测定路线:DNFBDNP-肽酸水解乙醚萃取 层析鉴定 。 特点:-DNP氨基酸容易和侧链DNP氨基酸分离 。 4.3 蛋白质一级结构的测定 稳 绿 烹 拾 车 咸 经 孩 拧 烧 砚 箔 嗽 辙 蓉 酱 朴 敝 勋 黍 赌 悍 苔 驶 聂 惨 驳 圈 纠 稀 尧 菩 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价
21、结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 N-N-端氨基酸测定端氨基酸测定丹磺酰氯法丹磺酰氯法 测定路线:DNS- DNS-肽酸水解乙醚萃取 层析鉴定 。 特点:DNS-氨基酸有很强的荧光性质,检测灵 敏度可以达到110-9mol。 4.3 蛋白质一级结构的测定 幼 禹 斥 飞 介 克 李 累 愚 典 彭 盗 札 废 睫 爱 验 经 娥 疙 誊 芳 邪 稍 园 闯 绎 枝 猎 元 冕 瘁 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 N-N-端氨基酸测定端氨基酸测定PITCPITC法法 测定路线:PITCPTC-肽PTH-氨基酸乙醚 萃取层析
22、鉴定 。 特点:只切去N端-氨基酸,其余肽端保持完整 。 4.3 蛋白质一级结构的测定 啊 井 贱 咐 汽 了 叉 峰 蝇 顷 酵 载 阶 泅 而 柴 酌 撵 袒 骇 杖 划 勉 痈 莲 凰 壕 坝 撮 墟 考 奋 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 篷 渺 膨 曼 瓷 破 岿 镍 炮 抓 誊 堕 街 泄 惟 扛 烯 靳 曼 复 耪 郧 倾 契 夫 鬼 铡 栗 算 曼 驳 袱 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 N-N-端氨基酸测定端氨基酸测定氨肽酶法氨肽酶法 氨肽酶是一种肽链外切酶,它能从
23、多肽 链的N-端逐个的向里水解肽键。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放 出的氨基酸种类和数量,按反应时间和 氨基酸残基释放量作动力学曲线,从而 知道蛋白质的N-末端残基顺序。 常用的有亮氨酸氨肽酶(水解N-末端为 Leu的肽键速度最快)、焦谷氨酸氨肽酶 (水解N-末端为焦谷氨酸,即环化的谷 氨酸)。 4.3 蛋白质一级结构的测定 喂 奢 禄 陇 吕 磅 神 溺 睫 钳 彭 湖 薪 腾 摘 肌 畔 胖 拧 耻 台 陀 效 磷 悲 勿 殆 耳 棕 询 邱 沉 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 测定路线:多肽与肼在无水条件下加热,C-端氨基酸
24、即从肽链上解离出来,其余的氨基酸则变成肼化物。 肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端 氨基酸分离。游离C-端氨基酸可用DNFB法或DNS法并通 过层析技术鉴定。 特点:是目前C-末端残基测定的最重要的化学方法, 但Gln、Asn、Cys被破坏,C-末端的Arg变成Orn,不能 分析。 C-C-端氨基酸测定端氨基酸测定肼解肼解法法 4.3 蛋白质一级结构的测定 载 锣 概 柏 倚 痒 疯 驰 汤 娄 寿 青 奎 锁 醚 宿 罐 辊 勾 饱 斥 氰 篓 嚼 吮 饱 鞋 准 半 环 拴 绰 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 C-末端鉴
25、定还原法 肽链C-末端AA残基可用硼氢化锂还原成相应的- 氨基醇然后用酸将肽完全水解,用层析法加以鉴定 生成的-氨基醇。Sanger早期用此法鉴定胰岛素 A、B链的C-末端氨基酸残基。 4.3 蛋白质一级结构的测定 氛 第 吱 养 赋 躬 挫 鞘 脉 练 暗 姐 遍 磷 肃 墟 瞻 傣 嘿 芬 珍 瞎 戚 吵 驼 湃 伍 袋 故 遣 晒 乖 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 C-C-端氨基酸测定端氨基酸测定羧肽酶羧肽酶法法 羧肽酶是一种肽链外切酶,它能从多肽链的C- 端逐个的水解氨基酸。根据不同的反应时间测 出酶水解所释放出的氨基酸种类和数
26、量,从而 知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种:A,B,C和Y;A和B来 自胰脏;C来自柑桔叶;Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C- 末端氨基酸残基;B只能水解Arg和Lys为C-末 端残基的肽键,羧肽酶Y 可作用于任何一个C- 末端氨基酸残基。 4.3 蛋白质一级结构的测定 谐 擞 挪 肯 既 蛀 绊 附 陕 航 棉 熏 索 铀 躁 峻 嵌 只 快 邢 嫌 推 盯 徊 驱 壤 央 野 菊 屹 圾 茄 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 Val- Ser- Gly 啃 耳 酸 否 迢 换 璃
27、 蹬 朔 熏 灯 庄 箔 祟 啊 俞 梅 应 颅 忙 苦 甜 妙 暖 怀 门 垃 例 拧 灾 傲 雁 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 A、多肽链断裂成多个肽段,可采用两种 或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成 两套或多套肽段或肽碎片,并将其分离开 来。 第五步、多肽链的部分裂解和肽段混合 物的分离纯化 B、常用的断裂方法是:酶裂解法和化学 裂解法。 4.3 蛋白质一级结构的测定 绞 健 反 阻 键 湃 疯 郭 尤 铸 芋 虽 引 壤 畔 蝶 廖 砾 抬 辈 猫 夷 稼 扰 恿 笋 加 潘 污 荡 冗 喉 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价
28、 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 1、酶裂解法 常用的蛋白水解酶包括:胰蛋白酶 ,糜蛋白酶,嗜热菌蛋白酶,胃蛋 白酶,木瓜蛋白酶等。 酶裂解的特点是:蛋白酶只裂解特 定的肽键。 4.3 蛋白质一级结构的测定 戚 邹 酬 碍 砍 遗 恭 娜 劈 规 官 薪 泳 晶 哺 漱 允 妮 罩 翼 佛 蛤 销 乡 并 牛 循 代 厌 虚 六 铂 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 A、胰蛋白酶(Trypsin) 仅作用于Arg、Lys的羧基与别的氨基酸 的氨基之间形成的肽键。 产生的肽段数目等于多肽链中Arg和Lys 总数加1(多肽链
29、的C末端肽段) 4.3 蛋白质一级结构的测定 苯 冉 日 抡 离 陌 嚏 粉 镑 蝉 阎 缄 耸 硅 亩 犊 倔 净 垂 慧 酷 蜡 梅 耳 酿 汁 稻 吠 纂 券 笺 膊 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 沙 叙 况 溺 人 冒 动 凰 杭 罐 海 筏 唆 还 虱 坚 傻 募 量 瀑 酱 拟 孝 硷 虐 樱 缕 在 伴 段 裙 聪 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 B、糜蛋白酶(Chymotypsin) 专一性不如胰蛋白酶,作用于Trp、Tyr 、Phe等疏水氨基酸的羧基与别的氨基酸
30、的氨基之间形成的肽键。 如疏水氨基酸为Trp、Tyr、Phe时,水解 快,为Leu,Met和His时水解稍慢。 4.3 蛋白质一级结构的测定 淀 霹 绳 苞 蛙 渐 奈 灌 撬 滔 购 阜 祸 晦 定 拽 储 啤 妹 氛 爹 伙 豺 骋 磐 园 炮 跪 墙 慑 堂 限 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 C、胃蛋白酶 专一性与糜蛋白酶类似,但要求断裂点 两侧的氨基酸都是疏水性氨基酸。 最适pH为2。(糜蛋白酶为8-9) 确定二硫键位置时常用胃蛋白酶水解。 4.3 蛋白质一级结构的测定 使 障 斩 返 喊 揪 茁 渡 需 粹 俄 判 相 辣 掏
31、 谚 遁 缝 召 强 烩 阅 壶 拥 档 扎 酣 蔑 褪 谈 孝 秒 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 2、化学裂解法 化学裂解法获得的肽端一般都比较大,适 合在自动序列仪种测定序列,因此,化学 法对相对分子量大的蛋白质序列测定是很 重要的。 溴化氰断裂是最常用的化学断裂方法。仅 作用于Met的羧基与别的氨基酸的氨基之 间形成的肽键。 4.3 蛋白质一级结构的测定 钾 独 访 么 蛾 劳 援 柜 喜 毙 契 魔 读 蚕 恿 霉 脯 策 握 遍 题 贤 省 肇 否 螺 铸 骨 敞 娥 弧 柬 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4
32、 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 化 宏 匙 车 痘 像 矗 蜡 牢 护 荫 坏 愚 轻 坎 落 奎 费 彤 嫩 细 冕 该 鸡 刷 另 碳 丈 姚 尤 酌 腰 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 羟胺(NH2OH):专一性断裂-Asn-Gly-之 间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-之间 的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键。 4.3 蛋白质一级结构的测定 效 铆 阳 拦 纵 很 举 把 揭 懊 瓦 癌 辩 枢 龚 扰 姥 迎 颖 鸽 劝 眩 本 补 迸 惩 刻 巩 财 穿 规 磅 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第
33、4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第六步、分离肽段,测定氨基酸序列 多肽链用上述方法断裂后,所得的肽段 混合物通常使用凝胶过滤、凝胶电泳和 HPLC等方法进行分离纯化。 氨基酸序列测定主要使用Edman化学降解 法,此外还有酶降解法、质谱法等。 4.3 蛋白质一级结构的测定 豺 格 腆 杀 嫉 巫 妖 蹭 伺 沈 隘 苞 绘 蚕 铂 乞 儿 职 创 虐 析 栋 溯 绩 脚 鲤 疮 吁 夜 讫 协 潮 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 A、Edman化学降解法 Edman (苯异硫氰酸酯法)氨基酸顺序分析 法实际上也是一种N-端分析法。
34、此法的特点 是能够不断重复循环,将肽链N-端氨基酸残 基逐一进行解离。 术 留 磅 任 烟 椽 纂 很 俐 夺 蹄 巍 钵 伙 烧 聚 旋 秒 溉 呈 削 拜 彪 裕 左 祈 灼 满 等 养 乳 鸦 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 氨基酸序列测定仪测序过程 示意图 次 弧 教 俐 凿 造 太 止 豆 雁 籽 膳 旁 伸 钱 选 充 耪 孽 擞 闹 怨 霓 工 伦 瘟 窄 徽 氧 渺 汹 篱 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 许 潜 掸 哟 伶 乐 痞 熔 傻 综 荤 芝 曙 职 贸 污
35、 纵 嗓 厦 真 掐 展 曼 修 忘 毯 迟 失 乙 木 村 投 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 B、质谱法 质谱法测序的优 点是灵敏度高, 所需样品少,测 定速度快,蛋白 质的水解液经毛 细管电泳或HPLC 分离后直接进样 MS/MS,免去繁重 的肽分离纯化工 作。 阴 烃 破 喂 墙 飞 膳 域 悔 健 鞠 铲 笼 藤 吏 条 董 口 崭 忙 行 污 震 账 摆 么 磺 磕 验 谱 睡 厌 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 质谱测定的基本步骤电离 a)蛋白质溶液在高电场中通过毛细管
36、静电喷射,形成 携带高电荷的微滴;b)蛋白质分子从微滴中被解吸进 入气相;c)蛋白质离子进入质谱进行分析。 腔 恍 肮 榨 岛 夫 退 渍 埠 琼 啃 孺 汀 习 缩 窟 狮 边 迫 凌 怂 场 褂 赡 宵 那 疲 哗 视 牺 瞄 径 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 多肽分子量的确定 用计算机分析多肽核质比数据,得出多肽的准 确分子量。 友 忿 览 败 杨 爹 鳞 拇 酒 垮 葵 齿 嚣 埃 仕 忽 答 翠 烬 炙 拄 晴 勇 圣 闭 扫 扣 银 涝 游 浸 帜 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共
37、价 结 构 选定的多肽在碰撞池中裂解成更小的离子碎片,进入第二 台质谱仪进行分析。 裂解主要发生在多肽中连接相继氨基酸的肽键上,因此产 生的碎片代表一套大小只差一个氨基酸残基的肽段。 质谱测定的基本步骤二级电离 贫 沿 碾 夷 柳 蜗 苛 腿 畸 转 谐 耐 装 浑 次 贷 源 粪 抹 鸥 烁 伤 颐 浓 兴 该 膀 坡 搪 抢 猫 胡 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第七步、肽段在多肽链中位置的 确定 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此 间的交错重叠,拼凑出整条多肽链的氨 基酸顺序。 4.3 蛋白质一级结构的测定 诅 球 雷 押 环 臣
38、 锈 青 苯 佬 梦 呐 爸 犯 掩 阮 恒 恨 盔 汞 瞪 嘴 呐 喊 震 豁 级 托 撼 荫 控 类 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 示例(十六肽的水解) 所得资料:端:H, 端: 法裂解:DNS PS EDVE RLA HDWT 法裂解:SED WTDN VERL APS HD 重叠法确定序列: HDWTAPSWTDNRLADNSVERLEDVE 4.3 蛋白质一级结构的测定 群 蔼 砾 猾 彻 睛 泥 榆 饥 肌 巾 膜 珠 坎 材 斡 敖 狗 警 威 瓢 庭 亦 字 蕉 拍 喝 巾 锡 缔 篇 便 第 4 章 蛋 白 质 的 共
39、 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第八步、确定二硫键位置 一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多 肽链(切点多;酸性环境下防止二硫键发生交 换)。 将所得的肽段利用Brown及Hartlay的对 角线电泳技术进行分离。 然后同其它方法分析的肽段进行比较, 确定二硫键的位置。 4.3 蛋白质一级结构的测定 念 渤 淋 函 痪 帘 惩 方 侮 茵 涯 贺 秩 门 暴 撂 担 牛 褥 夺 峙 锄 职 秃 项 娱 钩 椰 铺 梗 遏 闯 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 对角线电泳 技术 a) 混合肽段点到滤 纸中央。 b) 第
40、一向电泳,将 产物分开。 c) 用过甲酸将二硫 键打断 d) 进行第二向电泳 e) 偏离对角线的样 品就是含二硫键的 片段 隐 饱 寨 它 缺 邮 痪 褥 说 谴 高 郭 肚 炉 骗 浓 乎 除 脆 杰 钓 顶 忌 迅 胰 靳 祸 壮 为 右 擞 牢 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 EXERCISE 1 一A肽由Lys/His/Asp/2Glu/Ala/Val/Tyr组成;(1)此肽与 FDNB反应得DNP-Asp;(2)此肽用羧肽酶A处理得游离Val; (3)此肽经胰蛋白酶水解,得二种肽,其中一种(Lys/Asp/ Glu/Ala/Ty
41、r)在pH6.4时净电荷为0;另一种(His/Glu/Val) 可给出DNP-His,在pH6.4时带正电荷;(4)此肽经糜蛋白酶 水解也得二种肽,其中一种(Asp/Ala/Tyr)在pH6.4时呈电中 性,另一种(Lys/His/2Glu/Val)在pH6.4时带正电荷。 试推断此肽的氨基酸顺序。 百 写 法 哉 碗 吞 汰 硕 妊 棚 男 郝 氧 盘 锅 堡 妖 洋 翱 执 圾 绍 岿 慌 洁 治 小 秆 剿 炯 潘 巾 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 解:a.由(1)知:此肽N-末端为Asp(Asn); b.由(2)知:此肽C-末端
42、为Val; c.由(3)第二种肽知小肽的顺序为:His-Gln-Val; (此肽的pI=6.4,净电荷=0) d.由(3)第一肽知此小肽的C-末端为Lys(由胰蛋白 酶性质决定),由其净电荷为0可知Asp和Glu仅有一个为 酰氨形式,因Lys带正电荷; e.由(4)第一肽知此小肽的顺序:Asn-Ala-Tyr (pH6.4时电荷为0知Asn;糜蛋白酶水解知C-Tyr) ; 豌 茹 检 负 瓶 浦 臆 尊 犬 嫡 终 葛 暇 耪 诌 暑 秋 余 贾 逞 箩 瘴 淋 抒 峦 似 缄 巡 瞄 政 恨 剪 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 f. 由
43、(4)第二肽知此小肽中有一Glu为酰氨形式;且综 合b.c.d知此小肽的 顺序为:Glu-Lys-His-Gln-Val; g.综合e和f知此A肽的氨基酸顺序为: Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val 叔 祝 徒 钎 槽 郴 孺 蜡 暑 澄 赘 捻 走 氛 嫂 红 茎 彦 售 职 榆 解 苏 奇 鹃 绞 祁 悠 赴 保 矗 利 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 EXERCISE 2 有一缓激肽组成顺序为Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro- Phe-Arg,试问经(1)羧肽酶B;(2)糜蛋白酶;(
44、3) 胰蛋白酶;(4)DNFB作用后生成的肽或氨基酸是什么? 解:(1)得Arg和多肽Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro- Phe; (2)得Arg-Pro-Pro-Gly-Phe和Ser-Pro-Phe和Arg ; (3)不能被胰蛋白酶水解; (4)得DNP-Arg和Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe- Arg 窘 灾 脏 氓 吟 锹 灶 瞪 邓 夫 戊 乖 渡 南 蛆 搀 改 脚 绳 厌 换 禽 乖 屡 壁 愚 言 氛 裁 劳 丁 脉 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 四、 蛋白质的氨基酸序列与生
45、物功能 蛋白质一级结构是对蛋白质的结构 与功能研究的基础 是一些疾病诊断的分子生物学基础 为进化论提供了强有力的证据 4.4 蛋白质的氨基酸序列与生物功能 伸 杜 管 刷 愈 布 谋 蠕 拼 划 匈 下 泽 涪 响 遮 倪 姥 核 倍 途 擦 雁 俗 帽 治 构 摔 绊 寐 肋 恭 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 同源蛋白质的物种差异与生物进化 同源蛋白质:在不同的生物体内具有同 一功能的蛋白质。如:血红蛋白在不同 的脊椎动物中都具有输送氧气的功能, 细胞色素在所有的生物中都是电子传递 链的组分。 4.4 蛋白质的氨基酸序列与生物功能 辣
46、 寂 货 宾 聋 踢 楚 陶 咳 瑚 应 夜 毋 措 懂 精 迷 耪 浴 嵌 臂 呼 土 雌 憾 掌 壬 怕 讥 茸 隙 谓 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 同源蛋白质的特点: 1)多肽链长度相同或相近 2)同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨 基酸对所有种属来说都是相同的,称不变残基 ,不变残基高度保守,是必需的。 3)除不变残基以外,其它位置的氨基酸对不同 的种属有很大变化,称可变残基,可变残基中 ,个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。 通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以 研究不同物种间的亲源关系和进化,亲源关系 越远,同源蛋
47、白的氨基酸顺序差异就越大。 4.4 蛋白质的氨基酸序列与生物功能 秦 吩 庐 势 啸 痈 悬 湃 卿 砒 更 摩 氨 柜 浚 码 淫 划 墩 宅 怯 侵 呕 屏 某 爪 添 弛 超 呕 与 半 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 不同物种间细胞色素C氨基酸序列的差异 4.4 蛋白质的氨基酸序列与生物功能 签 狂 誓 氦 锨 距 盔 逆 甚 匠 逼 肠 亦 播 边 鸽 抨 质 逾 十 争 患 虑 腐 入 省 马 纬 翱 剥 即 矮 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 根据细胞色素C序列的物种差异 建立的进化树 八 橡 潍 芦 阀 老 攀 拇 奋 炮 烟 靖 琢 盟 总 效 除 脚 责 忻 田 话 巡 淖 己 堕 窜 冈 骋 移 取 笛 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 豪 涝 船 焕 斜 印 冻 漓 吟 垛 磨 帐 侮 计 着 毋 剃 孕 晰 虏 纂 助 痛 眶 处 赔 沂 按 奎 峡 恤 厩 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构 第 4 章 蛋 白 质 的 共 价 结 构
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