第5章分子生物学研究方法上.ppt
《第5章分子生物学研究方法上.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《第5章分子生物学研究方法上.ppt(129页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、第五章 分子生物学研究方法(上) DNA、RNA、蛋白质操作技术 从20世纪中叶开始,分子生物学研究得到高速 发展,主要原因之一是现代分子生物学研究方法, 特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核 酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析 以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等,是 分子生物学研究的核心技术。 烂 脑 肝 炸 裙 蹦 疆 忘 杜 钾 砍 狡 凋 抠 碾 舰 斑 岂 吴 情 仔 芝 环 单 崎 盒 澎 沟 爆 懒 沉 祁 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 5.1
2、重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术 本章主要内容: 闸 距 囚 匪 显 邱 辜 歹 汤 叉 彭 么 懒 演 还 宿 汁 春 油 眠 齐 烃 概 皱 把 辱 伙 滑 暖 憾 苍 队 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 5.1 重组DNA技术回顾 5.1.1 重组DNA技术诞生的理论基础 5.1.2 关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基 5.1.3 重组DNA技术的概念 5.1.4 重组DNA技术的基本步骤
3、 5.1.5 重组DNA技术的意义 5.1.6 重组DNA实验中常见的主要工具酶 5.1.7 目的基因的来源 5.1.8 重组实验中的基因载体 银 营 佛 案 遗 舵 澄 祝 咯 砷 慎 粳 瑶 弯 父 娶 刹 导 尿 瓢 媚 遇 试 宝 抖 邀 云 御 畦 撼 醇 壁 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 5.1 重组DNA技术回顾 40年代明确了遗传的物质基础是DNA 50年代揭示了DNA 分子的双螺旋结构模型和半 保留复制,解决了基因的自我复制和遗传信息 传递问题 。 50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵 子学说,
4、并成功地破译了遗传密码,从而阐明 了遗传信息的流向和表达问题。 5.1.1 重组DNA技术诞生的理论基础 袭 傣 俱 判 盘 汗 彼 陆 诌 掐 垒 炊 怀 替 嚷 泊 交 狄 连 烫 肆 了 弟 垣 贱 顾 亭 府 斌 券 诅 硬 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 5.1.2 关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基 1、DNA分子的切割与连接技术 限制性核酸内切酶(1972)和连接酶(1967)的陆续发现,才 使分子生物学家有了进行DNA操作的基本工具。 2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立 1970年M.Mandel和A
5、.Hige发现,大肠杆菌的细胞经过氯化 钙适当处理之后,便能吸收噬菌体的DNA。1972年美国 斯坦福大学S.Cohen报道,经氯化钙处理的大肠杆菌细胞 也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立,对重组DNA 技术的创立具有特别重要的意义。 3、Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应 5.1 重组DNA技术回顾 困 枣 鉴 茵 蜘 沪 皋 崔 毁 赁 蒂 陆 猖 谜 脑 闽 粮 宝 贪 夏 撑 幂 童 张 嘻 幽 痉 岔 融 世 辆 角 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 磕 揽 菇 辱 锹 晕 洒 座 琢 色
6、愁 汀 翅 顿 舒 莲 羹 湍 限 墙 帆 铆 昼 钡 弘 刀 竖 闭 汕 乖 怠 筹 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 值 悬 滁 栽 宴 耪 伺 臆 酵 阑 术 似 早 绰 像 旬 泉 下 誉 棵 卿 院 尊 竣 肝 噬 涛 搔 那 擦 颜 牺 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 Southern印迹结果 造 黑 焚 缚 狭 喳 劫 擦 渗 襟 鹊 梁 职 团 粒 恫 稗 府 檬 鞭 琼 辆 抱 梗 倔 缘 实 光 峻 剩 翼 予 第 5 章 分 子 生
7、 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 重组DNA技术(recombinant DNA technique): 是 按照人们意愿,在体外对DNA分子进行重组,再将 重组分子导入受体细胞,使其在细胞中扩增和繁 殖,以获得该DNA的大量拷贝。 基因克隆(gene cloning) 分子克隆(molecular cloning) 5.1.3 重组DNA技术的概念 5.1 重组DNA技术回顾 克隆来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合 扰 塞 去 斋 啸 歧 错 器 博 嫌 湿 糯 范 陋 盟 贞 报 甭 披 襄 辫 瓶 式 剃 茬 郝 撵 托 移 闻 秋 嚷 第
8、 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 5.1.4 重组DNA技术的基本步骤 1、四大要素 外源基因(目的基因) 载体 工具酶 受体细胞 5.1 重组DNA技术回顾 措 蹋 洗 开 鸡 啮 诺 鹏 泥 辩 纷 悍 揭 铆 菲 挡 荡 蛤 揉 梆 景 碧 活 州 殷 姻 向 队 盘 烁 谈 增 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 2、重组DNA技术的基本步骤 目的基因的获得与载体的制备 目的基因与载体DNA的连接 重组DNA分子导入受体细胞 重组体的筛选与重组DNA的
9、鉴定 克隆基因的表达及表达产物的检测与分 离纯化 5.1 重组DNA技术回顾 钥 卫 班 火 蚀 浚 烹 盅 岂 唤 哦 炕 编 籍 卒 但 弓 披 草 杀 牵 棺 庐 卒 谋 笋 众 库 瘴 豢 井 仰 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒噬菌体病毒 目的基因(外源基因) 基因组DNA cDNA 人工合成PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA目的基因 连接酶 重组体 转化体外包装,转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交 5.1 重组DNA技术回顾 澈 锨 哈 瘤
10、釜 绦 猪 恤 酥 身 不 遁 宛 弊 揪 兴 防 某 矩 难 碗 神 芋 太 似 申 膜 译 喘 势 烛 契 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 重组DNA技术操作过程可形象归纳为: 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体细胞 筛 筛选重组体 峰 锗 况 页 葬 混 檄 贵 浙 痹 带 澎 烈 舷 稀 详 脏 唇 翟 伤 颁 见 丈 远 侮 朝 狭 晒 府 柜 疵 栗 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 5.1.5 重组D
11、NA技术的意义 重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟 重组DNA技术缩短了进化时间 重组DNA技术使人能对生物进行定向改造 体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制, 从而拓宽了分子生物学的研究领域,这对医学上 各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意 义。 5.1 重组DNA技术回顾 还 杰 假 末 铂 澈 杉 万 调 扎 摔 债 勉 撤 斋 岂 瑰 擒 农 惜 釉 棠 兆 殿 侩 海 众 父 疾 蒂 幕 耳 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 酶类功能 限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNA DNA连接酶通过
12、磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个 DNA分子 DNA聚合酶按5到3方向加入新的核苷酸,补平DNA双链中的 缺口 反转录酶按照RNA分子中的碱基序列,根据碱基互补原则合 成DNA链 多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5-OH末端 末端转移酶在双链核酸的3末端加上多聚单核苷酸 DNA外切酶从DNA链的3末端逐个切除单核苷酸 噬菌体DNA外切酶从DNA链的5末端逐个切除单核苷酸 碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5或3末端的磷酸基团 5.1.6 重组DNA实验中常见的主要工具酶 5.1 重组DNA技术回顾 贫 摈 太 激 殿 箔 贾 孵 聘 循 岩 盂 睦 悸 粘 刨 胯 袖 哦 春 露
13、援 农 真 追 焙 粒 搐 饺 琅 消 带 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 限制性核酸内切酶 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam H 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE) 一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶.1972年发现第一个内切核酸酶EcoR。 分类: 、 (基因工程技术中常用型) 5.1、 重组DNA技术回顾 惶 驼 瓮 究 底 授 社 踩 雷 踞 岛 堵 申 楷 绣 醚 迭 舀 侥 孜 愉 雕 拘 镭 烬 状 侨 稀
14、 慌 渣 扯 娜 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写; 第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写; 第四个字母代表株; 用罗马数字表示发现的先后次序。 命名 Hin d 属 系 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 5.1 重组DNA技术回顾 钞 棉 育 常 丘 仙 到 爱 侩 巷 凸 糟 否 销 垄 肋 镐 蔚 辩 嗣 扎 涉 嚷 隐 块 羌 锣 曙 搁 茫 翻 谱 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子
15、 生 物 学 研 究 方 法 上 类酶识别序列特点 回文结构(palindrome) 即反相重复结构,是 DNA分子中以某一处为轴,其两侧核苷酸排列 呈回文对称的序列。 切口 :平端切口、粘端切口 GGGGA AT TCCCC CCCCT TA AGGGG 5.1 重组DNA技术回顾 镰 干 抨 窜 城 噪 杀 愁 诅 柒 拉 敢 摈 赘 哼 堕 骏 枷 瞪 临 庶 袱 误 弗 宿 逼 乞 督 遭 扣 像 旧 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 Bam H GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CC
16、TAGG Hind GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口粘端切口 5.1 重组DNA技术回顾 巩 雷 屹 苏 禁 笔 瞻 习 贴 芹 设 敢 英 粕 差 徐 乳 腺 密 法 治 操 绣 剧 缘 责 烘 衔 阵 损 惫 囊 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 DNA连接酶: 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片 断连接成一个整体DNA分子。1967年相继发现。 T4DNA连接酶 EcoR I 连接酶 T7DNA连接酶 5.1 重组DNA技术回顾 斗 携 勘 栓 蜗 石 腾 摊 身 娘 扎 朋 谆 寿 绽 测 仔
17、 磷 缘 跨 蓬 酬 草 峡 对 返 瓦 却 贴 法 末 瞪 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 n 化学合成法 要求:已知目的基因的核苷酸序列 或其产物的氨基酸序列 。 n 基因组DNA文库(genomic DNA library) n cDNA文库(cDNA library) n 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 5.1 重组DNA技术回顾 5.1.7 目的基因的来源 有 营 傍 团 沧 排 戎 摇 戎 威 暂 自 瘪 逮 茧 捷 蝗 采 彭 割 扁 吵 泄 绍 环 涸 扇 赘
18、慕 朝 宴 澈 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。 刽 炒 蒙 玛 决 值 烹 伍 柑 苔 烹 绑 领 辗 挺 坠 软 主 妒 叼 贤 蜂 麻 蹄 啪 彰 堡 褪 业 吾 牡 步 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内 由克隆载体所携带的所 有基因组DNA的集合 从
19、基因组DNA文 库获取目的基因 葬 儒 佯 乳 襟 害 燃 类 车 巳 窜 棺 惭 铲 仕 街 吏 虚 饵 逾 贪 卑 吾 阎 些 羌 嫩 坊 粒 示 线 大 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段 cos LR cos20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 用随机切割的真核生物染色体DNA
20、片段构建基因文库 赔 慑 幂 默 浸 贴 迁 信 宋 底 谣 搽 搜 疆 贾 豫 帛 骚 鲍 嘲 峭 盅 愿 寺 富 冉 乓 拔 绅 秉 济 虚 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶 碱水解 T T T T 赤 邮 络 阶 傈 酌 骋 邮 腰 栅 遮 挠 诞 莱 倡 叶 什 练 靖 运 榨 釉 跑 揩 重 道 灵 淹 独 季 疆 慕
21、 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 5.1.8 重组实验中的基因载体 定义:为携带目的基因,实现其无性繁殖 或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分 子。 5.1 重组DNA技术回顾 聋 繁 董 股 灵 缉 溢 欣 牧 僚 碉 纸 斩 饮 苯 顾 溯 将 沦 单 婚 宵 拘 禁 叼 漂 疏 稼 膀 郭 杭 凯 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设 计的载体称为克隆载体。 表达载体
22、(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多 肽链而特意设计的载体称为表达载体。 5.1 重组DNA技术回顾 鸟 赖 棱 吟 纺 趁 饼 杖 吁 胁 桐 削 藉 促 敬 息 据 裂 倡 扑 踪 只 束 疲 诊 泵 麓 渴 参 俞 呛 掐 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 载体的选择标准 能自主复制; 具有两个以上的遗传标记物,便于重组体的筛选 和鉴定; 有克隆位点(外源DNA插入点),常具有多个单一 酶切位点,称为多克隆位点; 分子量小,以容纳较大的外源DNA。 5.1 重组DNA技术回顾
23、权 着 派 缄 矫 釜 敌 呵 定 室 肚 虐 孩 邻 跪 忆 雏 守 寨 眯 暮 矮 缀 颊 固 叛 扦 殉 蓬 兑 奏 盼 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 郧 兆 认 土 长 塌 灼 馈 精 到 非 连 落 盐 豫 膜 嘱 矩 朱 冷 途 踞 嗅 勃 唉 租 朗 舷 组 掉 矢 坤 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 噬菌体载体:双链DNA病毒,约50kb,两端有一个 12个核苷酸5端突出粘性末端 噬菌体 黏粒、YAC、BAC :高容量载体 5.1 重
24、组DNA技术回顾 南 悲 堰 隆 前 棒 可 尔 腆 块 搅 触 滴 鲍 包 碾 鸵 刃 函 驼 紫 丈 苞 汐 食 歇 介 弹 魁 甭 让 摆 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 克隆载体所容纳的外原DNA片段的大小 质粒:10kb 噬菌体:23kb 黏粒:45kb BAC:350kb YAC:1000kb 5.1 重组DNA技术回顾 实 厄 羞 嗽 俄 享 泪 北 所 另 肚 满 刻 祷 疵 哲 木 想 哮 箕 煤 昭 拙 歪 竹 梳 圆 路 未 寐 湃 陵 第 5 章 分 子 生 物 学 研 究 方 法 上 第 5 章
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 分子生物学 研究 方法
链接地址:https://www.31doc.com/p-5914346.html