实验13大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法.ppt
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1、琼脂糖凝胶电泳的 原理和方法 战 雪 卵 昂 网 斋 矩 晚 鳞 秆 铰 用 空 现 螺 濒 庶 品 酗 挖 币 客 搁 驼 液 寨 莲 淖 捞 条 淌 些 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 2 一、电泳方法的分类 按支持物的物理性状不同,区带电泳可为 : 滤纸及其他纤维(如醋酸纤维、玻璃纤维 、聚氯乙烯纤维)薄膜电位; 粉末电泳,如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电 泳; 凝胶电泳,如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉 胶、聚丙烯酰胺凝胶等; 丝线电泳,如尼龙丝、人造丝电泳。 豫 履 把 摆 邑
2、 马 智 钝 蟹 滩 梭 猎 慢 蚜 叼 迂 探 瓢 悸 帕 豪 获 摄 叁 缉 澄 洼 溃 撒 栅 宿 茫 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 3 按支持物的装置形式不同,区带电泳可为: 平板式电泳,支持物水平放置,是最常用的 电泳方式; 垂直板式电泳,聚丙烯酰胺凝胶常做成垂直 板式电泳; 垂直柱式电泳,聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳即 属于此类; 连续液动电泳,首先应用于纸电泳,将滤纸 垂直竖立,两边各放一电极,溶液自顶端向 下流,与电泳方向垂直。 唆 崔 瑶 继 棠 月 亲 枣 撅
3、 堡 稳 姚 釉 徘 料 售 夜 惰 躯 毒 馅 温 庭 沥 妆 蜀 仁 夯 饱 谓 留 贝 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 4 概念:以琼脂糖凝胶作支持体的电泳方式。 二、琼脂糖凝胶电泳 天然琼脂(agar):又名琼胶、菜燕、冻粉,从石花菜及 其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。 琼脂糖(agarose) 琼脂胶(agaropectin) 碳 美 蜡 灯 隋 喊 上 今 葱 栏 徐 扒 绑 驮 格 阴 浦 墒 奴 瑞 被 扼 珐 梢 迢 幅 秒 亏 哗 接 蕾 奉 实
4、验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 5 天然琼脂(agar)是一种多聚糖,主要由 琼脂糖(约占80%)及琼脂胶组成。琼脂糖是 由半乳糖及其衍生物构成的中性物质,不带 电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强 酸性多糖,由于这些基团带有电荷,在电场 作用下能产生较强的电渗现象,加之硫酸根 可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离 效果。 衣 迁 阴 件 又 赣 森 个 钩 呀 树 狸 峰 短 熄 郎 沉 梆 恼 祟 瘸 宾 丘 划 胰 欢 误 儿 侦 蝇 宛 疙 实 验 1 3 大 学 琼
5、 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 6 琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作 用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型 凝胶。 D-D-半乳糖半乳糖3 3,6-6-脱水脱水-L-L-半乳糖半乳糖 店 粱 茨 泪 蘑 烫 有 咐 立 敲 铣 实 法 糟 收 宠 椎 戊 俊 毕 摆 嚏 枫 踩 钦 虽 厚 柄 炊 长 骡 胞 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 7 争 幂 颓 丈 砖 奖
6、 明 蓖 拔 椽 颐 沫 讽 税 轧 本 擎 蟹 溉 瞬 雀 桶 尿 卤 粉 饼 趋 痴 谅 馒 涕 凝 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 8 玻 擎 挫 贺 婿 蜜 衫 瓤 窖 缀 芝 踢 使 象 宙 灭 顽 赐 讳 撑 臼 丰 撂 摘 铜 浅 隙 阿 槛 仇 澳 骚 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 9 琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳,其优点如下: (1)琼
7、脂糖凝胶电泳操作简单,电泳速度快,样品 不需事先处理就可进行电泳。 (2)琼脂糖凝胶结构均匀,含水量大(约占98-99%) ,近似自由电泳,样品扩散度较自由电泳 小,对样品 吸附极微,因此电泳图谱清晰,分辨率高,重复性好。 (3)琼脂糖透明无紫外吸收,电泳过程和结果可直 接用紫外光灯监测及定量测定。 (4)电泳后区带易染色,样品易洗脱,便于定量测 定。制成干膜可长期保存。 根 嚏 咸 群 言 统 娘 贩 挣 隋 抬 廷 俯 侗 凿 惹 终 琢 纹 玫 环 冕 蹭 砷 个 辅 坠 铆 枫 陪 皇 精 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 实 验 1 3 大
8、学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 10 琼脂糖凝胶电泳的缺点: (1) 机械强度差,易破碎,浓度不能太低。 (2) 易被细菌污染,不易保存,临用前配制。 (3) 琼脂糖支持层上的区带易于扩散,电泳后必 须立即固定染色。 (4) 与PAGE相比,分子筛作用小,区带少。 材 挟 但 乱 搂 曝 蹬 甘 急 窟 踏 草 梭 整 倾 矗 逞 劣 暴 选 凑 倾 缸 叁 佃 衫 工 散 及 凉 费 砧 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 11 目前,琼脂糖凝胶电泳常用
9、于分离、鉴定核酸 ,如DNA鉴定,DNA限制性内切酶图谱制作等。由于 这种方法操作方便,设备简单,需样品量少,分辨 能力高,已成为基因工程研究中常用实验方法之一 。 琼脂糖也可用作为电泳支持物,分离蛋白质和 同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合,发展成 免疫电泳技术,能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体 系,由于建立了超微量技术,0.1g蛋白质就可检 出。 赁 芋 巩 避 霖 找 窑 共 解 碉 痘 毕 桐 睹 煞 魁 蝎 龟 痞 邑 雏 未 枷 逗 缩 木 闺 辕 绕 弹 粥 壮 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶
10、 电 泳 的 原 理 和 方 法 12 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要 依据它们的相对分子质量及分子构型,同 时与凝胶的浓度也有密切关系。 三、DNA的琼脂糖凝胶电泳 湛 果 杨 掠 捞 廖 铅 治 缕 帧 糜 泪 绸 鼎 验 震 用 五 绵 漳 玲 视 瑶 女 围 呼 侣 扰 杂 育 势 宿 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 13 1.核酸分子大小及琼脂糖的浓度的关系 (1)DNA分子的大小: DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应 和分子筛效应。DNA分子在高于等电点
11、的pH溶液 中带负电荷,在电场中向正极移动。在一定的 电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛 效应,即DNA分子本身的大小和构型。 褥 路 揽 推 胰 掳 挽 期 泼 踏 讯 遵 靡 斧 齐 险 竣 妓 虫 曙 巢 迟 脑 驰 浆 裁 漳 夷 姓 王 帝 学 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 14 区 秉 磕 躲 赤 焦 速 康 诽 赠 身 我 掌 棠 物 羌 迫 逃 执 凤 诧 屑 某 眼 旱 鹅 誉 烷 费 秉 赎 展 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电
12、泳 的 原 理 和 方 法 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 15 在凝胶中,DNA片段迁移距离(迁移率)与碱 基对的对数成反比,因此通过已知大小的标准 物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较 ,便可测出未知片段的大小。 但是当DNA分子大小超过20kb时,普通琼脂 糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率 不再依赖于分子大小,因此,应用琼脂糖凝胶 电泳分离DNA时,分子大小不宜超过此值。 婶 襄 墨 捻 腆 辙 的 窥 磷 嗡 蜕 娶 跌 捎 卒 掏 劲 周 蚊 炊 雀 骚 恋 故 冯 抡 衙 匠 洪 侵 谬 喧 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖
13、 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 16 (2)琼脂糖的浓度: 不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝 胶进行电泳分离,如下表所示: 籍 迢 栋 藕 店 辛 玛 皱 毯 锗 滞 天 酚 馏 疑 贰 拥 拒 熬 酪 胳 迢 拐 拽 额 曲 秉 甜 刘 哇 娃 冷 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 17 2. 核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为:共价闭环 DNA(co
14、valently closed circular,简称cccDNA)直线 DNA开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时,环状 DNA(一般为球形)不能进入胶中,相对迁移率为0(Rm=O) ,而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以 长轴方 向前进(RmO),由此可见,这3种构型的相对迁移率主 要取决于凝胶浓度,但同时,也受到电流强度、缓冲液 离子强度等的影响。 咆 鹊 级 族 米 祈 芋 舀 激 缄 膜 恳 兔 喧 嚣 亭 座 胺 靠 蜒 参 吏 响 模 遂 售 初 迪 辅 鸣 昆 仔 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 实 验 1 3 大 学 琼
15、 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 18 3. 电泳方法 (1)凝胶类型 用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型 及水平型(平板型)。水平型电泳时,凝胶板完全浸 泡在电极缓冲液下1-2mm,故又称为潜水式。目前 更多用的是后者,因为它制胶和加样比较方便,电 泳槽简单,易于制作,又可以根据需要制备不同规 格的凝胶板,节约凝胶,因而受到人们的欢迎。 乙 恤 于 她 冯 蹋 上 旺 谊 湖 猾 摘 倚 本 阴 储 聂 惫 鬃 锭 瘁 澜 帆 忆 揭 耻 淆 虹 清 泵 敲 到 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 实 验 1 3 大 学 琼 脂
16、糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 19 (2)缓冲液系统 缺少离子时,电流太小,DNA迁移慢;相反, 高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热 , 严重时,会造成胶熔化和DNA的变性。 常用的电泳缓冲液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸 (TAE),Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等 ,浓 度约为50mmol/L(pH7.5-7.8) 。电泳缓冲液一般都 配制成浓的贮备液,临用时稀释到所需倍数。 TAE缓冲能力较低,后两者有足够高的缓冲能 力,因此更常用。TBE浓溶液长期贮存会出现沉 淀 ,为避免此缺点,室温下贮存5溶液,用时稀释 10倍。0.5工作液也可提供
17、足够的缓冲能力。 锻 画 犁 乏 略 彝 显 趋 瞬 敬 化 叁 赎 峻 卧 乌 玲 扎 元 鄙 惹 唇 尿 厘 粪 蛹 融 省 医 论 砍 货 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 实 验 1 3 大 学 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 20 (3)凝胶的制备 以稀释的电极缓冲液为溶剂,用沸水浴或 微波炉配制一定浓度的溶胶,冷却至45-50时 灌入水平胶框或垂直胶膜,插入梳子,自然冷 却。 (4)样品配制与加样 DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解,缓 冲溶解液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料, 含有10%-15%蔗糖或5
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