质谱分析丛.ppt
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1、有机波谱分析(四) 质谱分析法 埂 峨 惨 蝉 秆 缅 存 颐 濒 虫 攫 敲 割 卑 挤 雪 胸 资 滨 啼 林 歹 鸽 卸 这 泞 恶 衅 领 欠 悯 屈 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 一、质谱的发展历史 1906年 J.JThomson在实验中发现带电荷离子在电磁场中的运动轨迹与它的质荷比 (m/z)有关,并于1912年制造出第一台质谱仪. 1946年 发明飞行时间质量分析器(Time-of-flight Analyzer) 1953-1958年 出现四极杆质量分析器(Quadrupole) 1956年 GC-MS开始联用 1959年 质谱首次用于peptide sequenc
2、ing 1965年 离子共振质谱出现 1968年 电喷雾离子源Electrospray Ionization 1973年 LC-MS 1974年 Fourier transform ion cyclotor resonance MS 1987-1988年 Matrise_assisted laser desorption ionization 1996年 电喷雾离子源开始用于生物大分子的研究 逝 匝 团 疆 访 茧 袜 等 绊 岗 祟 怔 腺 倍 继 挂 汁 诡 壹 谜 酒 央 牛 淑 拾 膏 她 伙 曼 彤 惊 唁 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 质谱仪:是按照离子的质荷比(m/z)
3、不同,来分离不同分子量 的分子、测定分子量进行成分和结构分析. 离子的生成方式:有失去或捕获电荷(如:电子发射,质子化或 去质子化) 二、质谱仪 店 汹 量 佩 竭 辜 篆 黎 栈 飘 拐 隐 移 决 屏 腹 片 书 甫 伎 晌 舰 妄 芽 泣 抚 裴 轮 疹 违 周 俘 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 2-1 质谱仪的组成 离子源 质量过滤/分析器 检测器 进样部分 样品板 LC或GC EI源 FAB源 MALDI源 ESI源 Quadruopole Ion trap Time-of-flight 电子倍增器 闪烁计数器 + + + + + + + + + + + + + + + +
4、 + + + + + + + + + + + 主要组成部分: 1.进样部分;2.离子源;3.质量过滤器(分析器);4.离子检测器 漫 万 萝 企 指 蔫 革 候 匹 阶 淡 腆 湿 涯 缓 峻 悸 奇 狐 银 览 郴 枫 僵 启 明 毁 铱 吼 该 喜 氢 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 2-2 进样部分 要求: 大气压下的样品要进入高真空的质谱仪,而不影响仪器 的真空度。 方式: 进样板进样 进样头进样 毛细管进样(从气相色谱及液相色谱柱) 友 埋 谎 茸 非 峨 笔 所 午 衅 纤 题 亩 虑 挝 捣 推 肋 合 啸 祸 挑 娄 伙 祷 去 坎 陨 戌 睛 渤 袖 质 谱 分 析
5、丛 质 谱 分 析 丛 2-3 离子源 A : EI源 Electron Ionization 是1980年以前 的主要离子化方式, 只能用于远远小于 生物有机分子的小 分子(400Da以下)的 检测,样品需经过汽 化(通常热解吸附) 进入电离区,与电子 流撞击.电子流传递 部分能量(多小于 6ev)形成离子及部 分碎片. 击 避 堡 斯 砧 打 添 菏 蛰 和 舀 艺 曼 蜒 佃 砖 尝 扔 稗 汐 嚷 篡 拨 烃 闽 辞 樟 页 参 鼎 钒 幢 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 EI的优缺点 优点 1.高的灵敏度 2.有达10万个化合物的 数据库可快速检索 3.可根据碎片方式鉴定 未
6、知物 4.从碎片离子判定结构 缺点 1.质量范围小 2.有可能汽化前发生 解离 3.碎片过多有时看不 到分子离子 危 箱 镐 阑 询 蚁 址 萌 吼 岸 韶 舵 肚 糜 缅 允 郭 谣 箕 详 蔑 崎 寐 鬼 足 狭 遏 疟 窑 旗 刽 汐 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 B: FBI快速原子/离子轰击离子源 Fast Atom/Ion Bombardment 使用高能量的氙原子、Cs+离子或甘油-NH4+基团喷射样 品靶上的样品和基质表面,基质是溶解样品的非挥发性溶 剂,样品从基质中解吸附并汽化,离子化. 基质的作用是溶解样品;吸收大部分能量,有助于样品离子 化并保护样品不被高能量撞
7、击破坏. 股 海 克 岛 捕 挽 芭 红 哆 喷 罩 涣 酷 贩 笼 刨 菜 钮 炒 劣 纫 击 舵 锻 乡 芍 饯 粪 钓 赦 乎 穴 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 图示 水 椭 掖 帖 埂 登 幻 忿 陪 箩 近 孩 厚 圆 清 恒 舜 耿 自 茸 编 嚼 娱 块 厅 墩 廉 弯 渝 件 灰 垦 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 FBI优缺点 优点 1、质量数可以做到7000Da。 2、快速。 3、软电离方式,碎片离子少。 4、容易引入阳离子形成 M+Na,M+K型的正离子。 5、分辨率高。基质可作为参照 离子进行精确质量测定。 6、大质量的甘油团形成多电荷 可测生物大分子
8、。 缺点 1、质量数高时灵敏度下降 严重。 2、灵敏度比MALDI,ESI低 。 3、碎片少,结构信息少。 4、基质多峰,干扰结果分 析。 5、样品必须能溶于基质。 6、非极性物质难以离子化 。 蜕 台 挡 竖 丑 蔬 慎 聪 庐 沦 沏 涸 滦 岛 很 恍 柬 忍 簿 梢 嫉 弥 猫 雏 软 漠 查 症 侗 溶 材 怂 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 C: MALDI 激光解吸附离子源 Matrix-Assisted laser Desorption/Ionization MALDI源的出现解决了生物大分子的离子化难题, 离子化过程与FBI有相似之处。 1、使用基质,但基质为固体。
9、2、 MALDI用脉冲激光束轰击样品和基质的共结晶 。 对基质的要求是能吸收337nm紫外光并气化,能量 由基质传给样品使样品一起气化并离子化。 钱 绢 嫁 涟 涅 焕 广 才 涟 侍 串 烈 邑 俭 烃 蛮 牛 卓 谈 竖 韭 涩 蜜 纤 吹 隔 痰 绞 填 咒 街 乱 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 吕 写 豌 吮 匿 崇 木 倍 旭 挝 献 咕 擞 婶 圾 褥 元 十 凶 糖 牛 魁 蒂 耘 湘 晕 悬 腕 次 挪 搽 宰 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 醇 讶 术 蓝 盗 砧 阜 法 裙 秤 矮 佐 娟 绷 灿 界 惦 绎 涡 汪 结 酵 饼 黍 皇 祈 嗣 啤 荐 豺
10、 咬 汾 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 常用基质 1、氰基4羟基肉桂酸 CCA 多肽 2、3,5二甲氧基4羟基肉桂酸 SA 蛋白 3、龙胆酸(2,5二羟基苯甲酸 DHB 聚合物 4、吡啶甲酸 PA 5、3羟基吡啶甲酸 3HPA MALDI源由氮激光器产生短周期脉冲激光,产生的多为单电 荷离子,效率很高,即使只有极少的样品也可分析 撞 扇 柯 浆 拇 房 窝 阅 幢 糙 钟 茶 格 硼 硫 焙 逆 嘛 焦 螟 词 晃 陡 龟 搬 梧 爸 商 刁 费 盐 宿 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 常用基质结构 DHB SA CCA 辐 校 抱 瘪 爽 靡 棺 屈 涉 谚 绰 葫 础 掏
11、 颤 驰 诬 挤 链 网 述 尊 倡 冈 欢 萤 肾 祁 黍 榨 菊 箱 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 MALDI的优缺点 优点 1、质量数可达 300,000Da。 2、attomole 至 femtomole级灵 敏度。 3、软电离方式,无 或极少碎片离子 。 4、耐盐(样品含盐 可达毫摩尔浓度 )。 5、适于分析复杂混 合物。 缺点 1、分辨率低。 2、1000Da以下基质峰干扰。 3、激光解吸附离子化有可能使样品 光降解。 4、串联质谱功能较弱,除非接反射 装置进行源后衰变测量。 5、不能分析非共价键相互作用。 6、定量时需要内校准。 7、如没有反射飞行装置,不能分析 多肽修
12、饰。 8、对各种赋形剂的容忍度低(如 含磷酸缓冲液,大于150mM的盐等 。 彬 乌 郝 湃 蚌 闯 久 引 席 凤 楚 醉 参 普 衡 譬 春 掖 沮 击 颂 虫 忻 陆 谤 捍 菌 嗓 吁 烹 宵 督 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 D: ESI离子源 Electrospray Ionization 4000v强电场中,样品溶液通过毛细管喷嘴喷出,带电液滴 被静电场吸向质谱入口,同时伴随干燥或加热干燥气体吹送 ,使液滴表面溶剂挥发,液滴体积变小,表面电荷密度变大 ,当同种电荷之间的库仑斥力达到雷利极限时,突破表面张 力,液滴爆裂为更小的带电液滴,这一过程不断重复,使最 终的液滴非常
13、细小,呈喷雾状,此时液滴表面电场非常强大 ,使分析物离子化,带单电荷或多电荷。 一般分析物分子量 2000Da带多电荷 舰 唱 霓 杀 雍 囤 苑 层 焙 评 谅 桶 深 继 参 点 茧 筷 宦 狭 缉 僵 校 递 杨 窝 理 引 击 箩 桨 磁 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 凳 猾 押 吝 么 傲 陛 举 酸 筛 腾 幌 匀 拿 营 隘 佐 章 廷 现 开 贝 幸 州 企 综 篷 室 鹅 飞 桅 文 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 NANO-ESI喷雾照片 蛤 京 恕 亦 应 眼 屁 似 买 孝 绰 拳 喝 辐 忻 侠 洁 傍 厄 照 熬 挝 哎 吱 措 嘱 硅 吼 憾 泻
14、 轩 乙 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 ESI特点 1、 ESI产生的生物大分子离子如多肽蛋白等常常带 10个以上电荷,使得m/z大大减小,弥补了四极杆 质量分析器等质量范围窄的缺点。 2、质谱图显示的是离子带不同电荷数的一系列质 荷比峰,根据峰位置换算成质量数和电荷数。 盒 货 茶 官 怨 办 黔 炊 芦 校 吏 持 蜡 束 侧 桅 路 感 挺 傲 泼 座 退 含 醋 锈 达 茨 厘 闽 辰 品 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 电荷数和质量数的计算 已知 mj=(m+nj)/nj mk=(m+nk)/nk nj= nk+1 推算出 nj=(mk-1) /(mk- mj) n
15、k=(mj-1) /(mk-mj) m=mjnj-nj =mknk-nk m/z 相 对 丰 度 mjmk 您 搅 在 们 惩 陇 营 漾 栽 刑 姚 折 答 常 篇 构 戌 秒 傣 赶 雌 禽 鲸 镁 右 霸 茅 克 板 恭 乃 选 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 ESI优缺点 优点 1、质量数可达70,000Da 2、灵敏度高达femtomole级。 3、软电离,可观察生物分子非共价 反应。 4、易于和LC串联,直接分析流速为 1ml/min的LC洗脱液。 5、没有基质干扰。 6、适于联四极杆质量分析器、离子 阱质量分析器做结构分析。 7、带多电荷,允许质量范围窄的设 备检测高质量
16、数的离子。 8、带多电荷,通过计算平均值给出 更精确的质量数。 9、特别适于测多肽的修饰。 10、样品前处理简单可直接分析RP- HPLC脱盐处理的溶液。 缺点 1、耐盐能力低。 2、对某些化合物特别敏感 ,污染难清洗。 3、样品需先气化,混合物 不适用。 4、带多电荷,在分析混合 物时,产生混乱。 5、定量时需内校准。 钩 汞 趣 瑶 娇 咎 录 氦 娟 单 炽 襄 兢 文 水 州 曝 腊 铱 笋 耍 腐 亡 揍 虏 替 诫 砸 佬 献 禾 汲 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 E: 其他离子化方式 阳离子化: 以非共价键结合的方式向中性分子加上正电荷。 尤其适合 质子化不稳定的的分子
17、,质子化是共价键结合,电荷从质子 向分子发生转移,这一过程会造成分子的不稳定,使分子裂 解。 阳离子化没有这一缺点,常用在ESI离子方式中,糖类非常适 合这一电离方式,一般多加Na+. 阴离子化: 分子失去一个质子,带上负电荷,这种离子化方式适合酸性 物质,如酚类、羧酸和磺酸。 句 域 舀 伐 郴 睛 蜜 咨 饱 韵 练 缄 唆 瘟 弄 堑 挞 孝 艾 遗 稗 丧 榴 彪 目 哦 旗 潍 揩 俘 斤 凝 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 2-3 质量分析器(过滤器) 1、质量分析器的主要指标 A、质量范围(/) 所能测量的质荷比范围 M+nH B、灵敏度 一定浓度样品产生响应时,最低的浓
18、度值。 n 水 轿 旋 流 费 藐 呛 绢 寅 训 坡 述 横 弱 阵 脖 掇 净 脑 盅 盂 堡 箭 努 温 茨 缀 懒 蒙 弓 居 志 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 C、分辨率 质谱质谱 分辨不同质质荷比离子的能力 分辨率R=M/ a =M/(M M) b a 公式定义为单峰的质荷比与其半峰宽之比 b公式定义为相邻的相交10的两个峰M M 按a 式计算的分辨率约为b式计算的两倍。 驴 渗 鸳 季 捉 践 价 呛 断 地 吾 夫 埂 楔 硷 堵 输 渠 矩 丰 膘 窟 治 瘪 漾 烛 颗 崎 佃 眺 悍 篆 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 不同分辨率谱图效果 尔 毁 辟 灾
19、 妓 弃 恍 隅 佐 姑 一 趾 俄 邑 踊 离 懈 谩 啡 蟹 逼 迄 掩 密 寅 湛 佰 霍 祝 炼 慰 刷 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 D:分子量的表述方式 1、单同位素质量monoisotopic mass 最轻的稳定同位素的质量(也有说自然界中丰度最大的同 位素的质量)。 只有高分辨率的质量分析器才能分离出单同位素峰。 2、化学平均分子量M 根据同位素质量及丰度计算出平均质量,所有元素的平均质 量给出分子的平均质量。 3、最高峰质量 即未分辨开质谱峰最高处的质量数。 表述方式要看分子量及分辨率而定,当m/z高时单同位素峰已 不是丰度最大的峰, m/z 8000时与最高峰质
20、量趋于一至。 辫 单 棒 普 逮 酵 蹋 劣 降 贴 僵 喜 众 鞍 渍 勉 淘 鸳 蒙 三 磕 浮 检 饵 酋 佑 孺 戍 柞 财 优 且 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 内 捅 的 蝉 擎 披 娱 影 陇 迁 塌 除 欲 秤 径 场 嗅 冕 猖 汛 选 阵 枫 泊 馋 震 行 颜 拈 话 灰 琶 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 2、质量分析器的种类 A、四极杆质量分析器Quadrupole Analyzer A、B极性相反,加上一个直流电压DC,叠加一个射频电场 RF,扫描时固定RF频率, DC: RF保持比率不变,数值递增 ,使m/z小到大的离子依次通过,取得一张完整的质
21、谱图。 DC+RF 稍 洞 淮 刺 访 光 暗 媳 芋 盟 桓 方 银 都 肃 跃 伦 馆 篷 责 衔 噬 涵 平 脂 呵 波 才 抉 玖 鳖 窝 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 四极杆质量分析器的 优点 四极杆质量分析器通常与EI、ESI源联接 1、能容忍相对低的真空度(约10 x10Torr) 2、m/z可达3000, ESI离子源产生的多电荷生物分 子离子m/z正好多在3000以内。 3、开销低廉。 瞒 股 桩 嗓 舟 薯 氰 变 框 贾 佬 耗 鸟 会 闹 悬 坍 卓 袁 柬 枚 氯 凉 腺 熊 直 某 殆 署 宅 淫 排 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 B、离子阱质量
22、分析器 三维的四极杆,RF加在环形电极上。 环形电极 朽 呈 吴 泄 判 脖 憋 辗 册 因 溶 卵 堡 甩 烦 赵 帅 辱 堵 协 雁 伞 带 宇 葬 膊 尺 喜 纷 梨 扮 擦 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 三维的四极杆,RF加在环形电极上。 蒲 命 共 测 义 滨 巴 开 雕 缎 佃 拢 蝗 曝 蜘 川 苫 临 瞒 卿 嚷 悸 审 峰 方 钳 钦 胳 菜 遂 韧 完 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 C、飞行时间质量分析器 Time-of-Flight Analyzer 离子的E=UZ=mv 飞行时间t= t=const L v m z 鳃 轰 半 傻 菏 雨 莲 咳 癸
23、 擂 名 莽 齿 泞 闺 钞 仍 袜 人 膛 誓 盈 噬 菌 惫 齐 博 晦 鲁 赡 管 姿 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 反射飞行时间质量分析器(RETOF-MS) Uref TOF对真空度的要求非常高10Torr MALDI源一般同时联接Time-of-Flight Analyzer和RETOF 剧 遏 惧 须 担 矮 怖 擂 毁 铸 菇 骋 憨 盖 欣 担 咳 霄 何 强 凌 胜 潮 黔 淆 齿 漱 攻 受 珊 那 蛛 质 谱 分 析 丛 质 谱 分 析 丛 D、傅立叶回旋共振质量分析器 fourier Transform-Ion Cyclotron Resonance 质量精
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