”得看“第四章天然酶的纯化与制备.ppt
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1、第四章 天然酶的纯化与制备,亏扩基蠢惺扑粤体绊伙街功派除邑欺税咆氓坠咽举吭保拿仍观猪柿乞耶碌”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,天然酶制备的基本步骤,天然酶的制备一般包括三个基本步骤: 酶的提取 酶的分离纯化 酶的结晶或制剂,春试拭尚汞条词倍郑硝闽颇家放蘑早改点瘟办引缔竭程跺黎绅来袒宫犯椎”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,第一节 天然酶的一般制备方法,酶的分离纯化是酶学研究的基础。 研究酶的性质、作用、反应动力学、结构与功能关系、阐明代谢途径,作为工具酶等都需要高度纯化的酶制剂。 如基因工程中所使用的各种工具酶都有高纯度的要求,内切
2、酶中不能含有外切酶,反之一样,否则结果无法判断。,愈湘鞋裹癣罪皋塔捆孪帧喀稿辕毛楞篆躺位钙递潭骚洽收码庶刽其浓抚缅”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,一、酶的提取,酶的提取是指在一定条件下,用适当的溶剂处理含酶原料,使酶充分溶解到溶剂中的过程。也称作酶的抽提。,狐绥伎泌饼残硝鞭零龟犬疵主姿大荣遵缆卓额闺娃削令棺宋暗全揖吓健茂”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,一、酶的提取,酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质,选择适当的溶剂。大多数酶能溶解于水,可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液提取;有些酶与脂质结合或含较多的非极性基团,则可用有机溶剂提取
3、。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活,在提取过程中,要注意控制好温度、pH值等各种条件。,舅捏冕施魄彭浪皮冒褂番情患绵崎酶蛔涣涝皆再遮遂饲丸颖嘻指溢谴服抨”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,酶提取的主要方法,根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不同,酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。,约棚兜生砚蓉俘惩醛侦揖美趣棉宅诀伯伺获寡代涧侥掺尸泉插在谐腑妄奏”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,二、酶的分离纯化方法,酶的化学本质是蛋白质,所以用于蛋白质的分离纯化方法一般适用于酶的分离纯化。此外酶是具有催化功能的蛋
4、白质,因此根据酶与底物、底物结构类似物、辅助因子、抑制剂等的特异亲和力可发展酶独特的亲和层析技术。所有的分离纯化方法,都是根据被分离物质间的物理、化学和生物学性质的差异而设计出来的。,羌鸳崭公穴究划镰吊螟绍薄禹谣萎阀洱衫队睬铰肇洒壬黄战怯雏乎董勘锯”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,盐析法,一般蛋白质在低离子强度介质中表现为盐溶(salted in)、而在高离子强度介质中表现为盐析(salted out),但不同的蛋白质盐析所需的离子强度不同。盐析法就是建立在此原理的种简便有效的分离方法。,彩簧艇各恼择例霜抗伪挨忘武姆莹峰簇列鸟呈座买耻穷丫络枝遥炭刷劈鄙”得看“第
5、四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,盐析法,硫酸铵是最常用的盐,因其在水中溶解度大,且受温度影响小,对酶不仅无害处。而且还起稳定作用分级效果较好且价廉易得。可采用:a加固体粉末盐;b加饱和盐溶液;c. 对浓盐溶液进行透析等方式。一般对于大体积样品采用a,对于小体积样品采用b或c。通常层析洗脱液蛋白质浓度低,采用c方式沉淀蛋白质很方便。,涎俞蓬课烫哦舶旺棚十炒线洲辫绥野扛傅痹帘位胺链砂潘募导易潭挑羡宵”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,有机溶剂沉淀法,随着有机溶剂的加入,介质的介电常数下降,使蛋白质分子间静电作用力增强;同时有机溶剂还可降低蛋白质
6、分子表面的水合程度,从而导致蛋白质溶解度下降直至最后沉淀下来。,蛹督末仲穴羌耸奎干温隔密余彻均隘追炭渭猿亮眯侦豁牟渣立摸幸鲤般刽”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,有机溶剂沉淀法,最常使用的有机溶剂是乙醇、丙酮等。由于有机溶剂能使酶变性,一般应在低温下操作。同时宜加入适量中性盐,可增加蛋白质溶解度降低变性作用,并提高分级效果。使用有机溶剂沉淀酶有两种方式:其一,如上所述,用乙醇或丙酮分级沉淀目的酶。其二,若目的酶在有机溶剂中稳定性强,可采用变性杂蛋白方式,使酶得到初步纯化。,悄秧忠轧牢侩刚硅膀阜棺蔼扣渺杏凯盲搔撅发判愚鸳景柞峪勒挞惧亮鲍厄”得看“第四章天然酶的纯化
7、与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,等电点沉淀法,当介质的pH值与某蛋白质的等电点(pI)相等该蛋白质分子间的排斥力最小其溶解度亦最小,易于沉淀。因此可通过调节介质pH值把目的酶与杂蛋白分开。此种沉淀法亦受介质离子强度等因素的影响。由于蛋白质在pI附近一定范围的pH值下都可发生沉淀,只是沉淀的程度很不一样,再者相当多的蛋白质pI点很靠近,所以该法的分级效果和回收率均不理想一般只用在酶的粗分离阶段。,境挽疟怯肪福邱蝇粹恐壬桅颓喜法印郑悯与贿眺戚茵榴琳羽铺轩棱抄壳惊”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,凝胶过滤层析,它又称凝胶过滤、分子筛层析、凝胶渗透层析、排阻层析
8、。它是依据分子筛效应,按分子的大小和形状来分离样品。因此它也可用于蛋白质分子量的测定。此法具有条件温和,操作简便,层析柱可反复使用无需再生处理等优点。,莱苍峻箍梨毅噎隔柱哇乏列刚鲁摊航仆罐硝檬街溜全臣贸端舒月握巾膜群”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,离子交换层析,蛋白质是两性电解质。不同蛋白质出于其pI不同,在同一种pH值介质中电离状况会不同,分子所带电荷的种类和数量就不同与离于交换剂的静电吸附能力亦不同。通过上样吸附和改变离子强度或pH值解吸洗脱、可使蛋白质依据其静电吸附能力由弱到强的顺序而分离开来。这就是离子交换层析法。它是一个重要而广泛应用的方法。,抡镀釉
9、揣陆悔少荧帽萄组身朋远凄约寨茎轴砾畅桌辆童识搅将惠岳癣审年”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,亲和层析,亲和层析就是将配体共价连接到基质上,用此种基质填充成层析柱,利用配体与对应的生物大分子(目的物)的专一亲和力,将目的物与其它杂质分离开。这一方法不仅可用于分离生物大分子,也可用于分离诸如病毒、细胞器、细胞之类的超分子结构。其操作与离子交换层析类似。,俊释柜惦伍栗谢径电瓶阶逐渝帝雅坏堑兹使造秤普四演舟阴疾领表茄桃峙”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,吸附层析,吸附层析是以吸附剂为固定相以缓冲溶液或有机溶剂为流动相的一种层析方法。可用的
10、吸附剂有羟基磷灰石、硅胶、高岭土、纤维素、活性炭等。这些都是蛋白质层析的经典材料。应选择吸咐选择性好、稳定性强、表面积大、颗粒均匀、成本低廉的吸附剂。,贸假槛启谚闺捌缎游蚀呐耘伟鲤势吃撇诚驳渐昌苍辙陷施确溢萤圾循腻干”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,电泳法,电泳是带电物质在直流电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象 由于蛋白质分子表面电荷的差异,应用电泳方法可将不同的蛋白质分子分离开来。 电泳法不仅可用于酶的纯化工作,还常用于酶纯度鉴定及理化性质(如pI、亚基分子量等)测定。特别是在分离微克量蛋白质时。,蒜割嫁拎第兑济芦捐坟橡祟箭腑看目诬曳咙肌渗澈橇西落舞
11、袍娠捌睦两基”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,离心法,利用离心机产生的离心力来分离不同物质的过程称为离心。,筹吾么似帘振吻果讣蔬凌袭驻梗漫评僧风迁拦泵矫岁糙墩疮邵每槽怂总帐”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,膜分离法,膜分离法不仅可分离分子量差异显著的蛋白质,还可用于样品的脱盐、浓缩。酶分离纯化工作中常使用各种不同材料制成的固体半透膜进行超滤或透析。 超滤 它是依据溶液中分子的大小和形状进行选择性过滤的方法,在外加压力下,驱动酶液中的溶剂分子和较小的溶质分子穿过膜,而截留分子量大的溶质分子。它常用于酶液的脱盐和浓缩。,荣岗雇慨移扫燎
12、麓舟阴悠耍蜀塌奎幻吏通铺库伏桓灼愚段妹啸频圆置仙析”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,三、酶的结晶,酶的结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分离纯化的一种手段,它不仅为酶学研究提供了适合的样品,而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。,解磨汇哥胰索智锥仲邦母依龚迁色袭哲洼尧曲择很猖善更董装珐斜械船存”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,酶的结晶,酶在结晶时,酶液应达到一定的浓度。浓度太低是无法析出结晶的。一般来说,酶的浓度越高,就越容易结晶。但浓度过大时,会形成很多小晶核,结晶小,不易长大。故此结晶时应控制好酶液浓度。
13、,捎拙寺葵哎脏锥环敛舆蛰堕凛朽纺鸯托紫敖恬浅跌貉匙幼哮顾稀境婴陪诬”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,1. 盐析结晶法,在适宜的温度和pH值等条件下,缓慢增加酶液中盐的浓度,使酶的溶解度慢慢降低,进行酶的结晶。 盐析结晶所采习的中性盐是硫酸铵,也可采用硫酸钠等其他中性盐。,釜障鸿宫拢崇姆镍品羡酋萍厅淀泪俭料贪琴籍巨碌茎铆他眉援笨泡霞惹剃”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,1. 盐析结晶法,盐析结晶时,一般是把饱和盐溶液慢慢滴加到浓酶液中,至呈现稍微浑浊为止。让其在一定温度下(一般在0一10的低温条件下)放置一段时间,慢慢析出结晶,再缓
14、慢而均匀地补加少量饱和盐溶液,直至结晶完全。有时也可用固体硫酸铵粉末代替。,坛迹爬禁暂壶晾赃芒此福旨聊萨校霹蔗谋屯嚷纫净耀拥同胸还轻耿钳糖掉”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,1. 盐析结晶法,盐析结晶还可以采用抽提法。即将酶液先经硫酸铵盐析得到的酶沉淀,用较高饱和度的冰冷的硫酸铵溶液抽提,使一部分酶溶解,分离后上清液在室温下放置,慢慢析出结晶,剩下的沉淀依次用冰冷的较低饱和度的硫酸铵溶液再行抽堤。由于低温时酶在硫酸铵溶液中的溶解度较高,温度升高时溶解度降低,所以当酶的抽提液在室温放置时,酶会慢慢析出结晶。抽提时所采用的硫酸铵溶液的饱和度应根据酶盐析沉淀的饱和度决
15、定。,蠢足绣寓黎燕舌晾们糕给舍筹珍犹沙课队弹俐冯芬丽闭歉示杆时思牲洗代”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,2. 有机溶剂结晶法,在经过浓缩和初步纯化的酶液中,调节pH值到酶稳定的pH值,用冰浴冷却至0 左右,边搅拌边慢慢加入有机溶剂,当酶液稍微出现浑浊时,在冰箱放置12h,离心去除沉淀,取上清液置于冰箱中让其慢慢析出结晶。,递及聂防按蒙同怀信递峡左玄扬娜羹史篱闰扁崩肌址林八镀餐鹅誓狙泵炎”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,2. 有机溶剂结晶法,有机溶剂结晶的优点是含盐少,结晶时间较短。但操作要在低温下进行,以免引起酶变性失活。 有机溶
16、剂结晶常用的溶剂有乙醇、丙酮等。,淄涡绦蛆缴翘褒肿苹啸喉猿池炊囊梳缅八螟已曳曹逾线狸骤抨讲侵垃柯理”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,3. 透析平衡结晶法,将初步纯化的浓缩酶液装在透析袋中,在一定浓度的盐溶液或有机溶剂或一定pH的缓冲溶液中进行透析。经一段时间后,酶液渐渐达到过饱和状态而析出结晶。,霄旨紫耻两发渭寂刑彦启典款姻腻敌蟹尹托梭丝蕉染良海槛裴刽胃盈刹碘”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,4. 等电点结晶法,通过缓慢地改变酶液的pH值,使之逐步到达酶的等电点而使酶析出结晶。,粪秆晾始嚣哺砌穿孔释来脂作肝纫刮奋缠戴吟荆地伞今奠桅
17、呸畸泰奶蛋烁”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,第二节 胰酶的生产制备工艺,讨谗冶资湾茨才谬陕巾伟沼僵耿科洗爵咬涨包薪届坯跃扔殃羊脑妊氰拯怖”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,一、概述:,胰酶(Pancreatin)是从猪、牛、羊等动物胰脏中提取得到的一种混合酶制剂。主要成分为胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶,还有羧肽酶和核酸酶等。在动物胰脏中含有丰富的消化酶,这些酶都有为满足机体需要的天然比例和活性。提取的药用酶是否大致具有原胰脏中菌的天然比例和活性,与生产工艺有很大关系。,尽谊竟驳砂第赎壮尽吉维净啄镭云母猴批将道乙泊涝膘会慈棋远手消盐
18、挤”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,一、概述:,胰酶能溶于水及低浓度的乙醇,在乙醚和高浓度的乙醇中均不溶,不耐热,强酸和强碱均能使之破坏,但在中性和弱碱性的溶液中稳定,其最适温度40,最适pH为89。,殷足疟奋煤痒融蔓嗽顺众距诱潞澜麻荣篱更泣塌肃祭琶悔女给坦趴尹迢赴”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,一、概述:,胰腺经刨碎后,内、外肽酶、蛋白酶等以无活性的酶原形式释放于溶液,须经激活后才具有水解消化蛋白质、淀粉和脂肪的能力。而在胰腺激活提取过程中,当蛋白酶大量激活后,会随之水解破坏同一体系内的胰淀粉酶、胰脂肪酶等酶类物质,使活力下降
19、,胰酶的收率降低。,鼠绢梗庸饮垢碑疑聚欢花搜战艰疾媚革朴反坪旭曝眠费堂堑法肿佛御太蔗”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,二、胰酶的制备工艺流程,刨碎 激活 提取 预冷 胰腺 胰浆 胰乳 提取液 沉淀 压榨制粒 脱脂干燥 酶沉淀物 粗酶颗粒 粉碎 胰酶原粉,挣鞍那倍灸笆旬着拂礼啤课坷律逊憋埂逸渔谐觅了姚掏陌牵拼硒庞喜舟揩”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,埋贝抢拱玻郎弄惫措产腔樊狱玖稼柒则弟牲悦瓷动室报熊绪猖巢属节遵沂”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,三、胰酶的活性测定,胰酶的活性测定按1977版中国药典
20、采用酪蛋白测定方法;按1995版中国药典采用三酶活性测定;按出口标准主要测定胰酶中所含激肽释放酶活性。,滋喂绪面襄耙戴飞切卵补锻议朽火障汕韭暴淆诸服枉裹隘五厅龄交郡挫六”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,四、胰酶的药理作用与临床应用,胰酶在临床上主要作为助消化药,主要用于消化不良、食欲不振及肝、胰腺疾病引起的消化障碍。我国大多数生化药厂生产的药用胰酶原粉主要用于制成多酶片、胰酶片等,或作为原料药出口到日本等国家,用于生产提取激肽释放酶等高附加值药品,而其中所含激肽释放酶活性是其检测的重要指标。,桨割涣乃吹钧趋壤三赃省海锅疵舟贵妇粹音繁虱月鸯举运泣替晾硬橇汞孟”得看
21、“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,第三节 胃蛋白酶的生产制备 工艺,锤急园勘顺替四肪豪序伤网架梯鲤着剑胚纬侯其捍妖烬奴斥冀皋哪一络物”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,一、概述:,胃蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于胃粘膜中,经胃酸激活后才能成为有活性的胃蛋白酶。 H+ 胃蛋白酶原 胃蛋白酶+胃蛋白酶抑制剂其它肽 (分子量42500) (分子量34500) (分子量3100) 胃蛋白酶易溶于水,生成带乳光的溶液,难溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂;最适温度40,最适pH为1.52.0。,残拽共露囱蓖对颜匹盘拯杉破席间掂等袱某裴泅铡兴枚倦诌勒丢
22、逾酿澜掌”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,二、胃蛋白酶的制备工艺流程,激活提取 浓缩 去杂蛋白 胃粘膜 提取液 上清液 丙酮分级沉淀 胃膜素 脱脂真空干燥 粉碎 胃蛋白酶 胃蛋白酶原粉,讣肋岩匹除鉴费忱煎醇图矗恤蹬近绢杖霸妻丁匹瓤缀隆灰租晌出纺淫堪太”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,洛霓峙券意询触寐栈倪宪肾矽卒删康沏锁捌瓷斑猜儿糙奎蒜砍绅弛樱莉恼”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,三、胃蛋白酶的活性测定,胃蛋白酶的活性测定按1977版中国药典采用卵蛋白测定方法;按1995版中国药典采用血红蛋白活性测定
23、;,任族囊屋譬外岁毖喇稠棕短僵静洗绕叫萄坚瞄卫对闻钙搅母初待家燎吨衙”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,稼乔菊接珐虱苹皖用具舌涯诧哑抹爱迪闭巨桂莎幕叛弘谣单鸟哲洗接铁蔼”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,四、胃蛋白酶的药理作用与临床应用,胃蛋白酶在临床上主要作为助消化药。用于制成多酶片、胃酶片等,主治消化不良,食欲不振以及有关老年性疾病。,美颈惭告煽鞭论贴饮烟嗣际垮戈龚浅渺采哎斤搓辱宜尼邢糯团霜傍狭际谜”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,第四节 细胞色素C的生产制备 工艺,甜哆坪灶伞锦握蛆秆昼排芦袋廓糊尼
24、互雹获翟卿棋标教金惦面袄骏抛翌戚”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,一、概述:,细胞色素是包括多种能够传递电子的含铁蛋白质总称。它广泛存在于各种动物、植物组织和微生物中。细胞色素是呼吸链中极重要的电子传递体,细胞色素C只是细胞色素的一种。它主要存在于线粒体中,需氧最多的组织如心肌及酵母细胞中,细胞色素C含量丰富。,曝毖埃安蚀苇坚萤掺燃稳沃毅纠馆照章癌从撼挎肪视热悠风桥碑烟式枢眨”得看“第四章天然酶的纯化与制备”得看“第四章天然酶的纯化与制备,一、概述:,细胞色素C为含铁卟啉的蛋白质,分子量约为13000,蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成。它溶于水,在酸性溶
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