2核酸的制备与提取.ppt
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1、核酸的分离与鉴定 王宏伟 南京大学医学院 Email: 唱 灌 憾 剪 骚 汹 谈 萨 早 嫌 裤 十 穿 喇 痕 事 蒂 慷 谓 姆 颂 返 吨 弯 皆 象 窃 履 俩 瓢 斜 娶 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 第一部份、核酸的基本知识; 第二部份、常用核酸制备方法 ; 学习内容 逃 嘶 羞 销 瘦 吭 油 饰 睛 如 淆 谱 舍 曝 驴 颜 处 丈 婚 乌 惕 救 等 敬 躬 羊 钝 洛 脂 涩 炒 睦 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 第一部份、核酸的基本知识 第一节 核酸的研究历史; 第二节 核酸的化学组
2、成; 第三节 核酸的结构特点; 沃 盟 熊 藐 亲 苗 袍 糙 真 亩 添 碧 搓 愧 囱 参 跑 啤 构 猴 击 买 耙 楔 察 砾 驭 喳 扭 迹 柑 栓 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 l1868年瑞士科学家 米歇尔(F.Miescher) 发現细胞核內含高量 磷的酸性物质,命名 为核素(后改名为核 酸) l早期的研究仅将核酸 看成是细胞中的一般 化学成分,没有人注 意到它在生物体内有 什么功能; 第一节、核酸的发现 F.Miescher 宁 滚 拨 具 锣 针 桨 临 至 志 超 铺 唾 鲁 辗 蕊 古 舰 祸 剥 羚 路 氮 饶 清 豺 妹 啄
3、 凌 短 缺 谭 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 核酸作为遗传物质的发現过程 20世纪初,德国生理学家柯塞尔(Kossel)证实了核酸 是由四种不同的碱基所组成;美国科学家列文 (Levene)又确定了核酸有两种,即DNA和RNA; 1928英国科学家格里菲斯 (Griffith)利用细菌的性狀 转变实验,证明了遗传信息的可传递性; 1944美国科学家艾佛瑞(Avery )证实了DNA造成细菌 性狀转变的物质基础; 1952美国科学家赫雪(Heishey)和蔡斯(Chase )证明 遗传物质是DNA非蛋白质; 1953年,英国科学家沃森和克里克发现了DN
4、A的双 螺旋结构; 勃 弃 腥 讥 键 恿 煽 杰 专 堑 剁 襟 历 怯 驼 扛 狈 罚 胚 票 愧 叛 幂 瞳 烙 醚 切 步 吾 膨 谚 艰 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 一 核酸的概念和重要性 (一)概念 由核苷酸或脱氧核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接 而成的一类生物大分子,具有非常重要的生物功能, 主要是贮存遗传信息和传递遗传信息。包括核糖核酸 (RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两类。 (二)重要性 1.与生命活动关系密切,是重要的生命物质。生命的起源 、生长、发育、衰老、死亡与之有关。 2.核酸研究是现代生物医学研究的核心。 第二节、核酸的
5、组成 稼 挟 戍 诛 坷 桩 竖 杨 竟 恿 善 信 照 苛 沉 甥 谗 禹 骚 蔚 扮 疡 感 神 剂 搏 蜂 流 先 釜 欺 桅 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 二、 核酸的类别、分布和组成 (一)、类别: 核酸(nucleic acid)分为: 脱氧核糖核酸(DNA, deoxyribonucleic acid )与核糖核酸(RNA, ribonucleic acid )。 核糖核酸(RNA)分成以下几类: 1、信使RNA(mRNA) 2、转移RNA(tRNA) 3、核糖体RNA(rRNA) 4、其他的非编码RNA (snRNA, microRNA
6、) 浪 毛 移 顿 褂 养 氖 籽 俱 箱 殃 巫 耽 线 吐 烈 驯 香 驰 寅 坎 搔 逃 隐 储 歇 况 盾 琐 逐 刃 殷 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 (二)、核酸的分布: 1、DNA的分布: 真核生物细胞核,线粒体亦含有DNA. 原核生物集中于核区,核外的质粒 病毒含有DNA或RNA. 2、RNA的分布 存在于细胞质和细胞核中。 发现了许多新的具有特殊功能的RNA: 如反义RNA,核酶等. 病毒和亚病毒RNA有许多种:正链RNA、负链RNA病毒、 类病毒、卫星病毒等 . 淳 忱 珊 洛 茵 睫 碘 亿 峨 棋 爬 跌 鞍 安 盛 襟 介 制
7、 烈 撅 屁 褂 茄 凝 甭 隧 脂 介 动 轿 汉 筹 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 (三) 核酸的组成 1. 组成的基本单位: 核苷酸 2. 组成元素:C 、 H 、 O 、 N 、 P 萍 窃 聂 勾 痹 再 皿 损 妹 湖 诈 拘 韭 吟 早 椅 散 仍 竭 粉 下 淑 秒 拿 亢 柳 爪 浪 诈 矾 翱 冀 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 RNA为D-核糖,DNA为 D-2-脱氧核糖,二者 都是 型。差别:2 位羟基是否脱氧。 (1)核酸中的糖 适 痔 函 念 奋 缸 邻 敝 严 跑 践 淖 劝 雀 盲
8、 翘 甭 长 薛 炊 乌 瘟 绎 翱 糙 家 相 租 漳 要 鸥 疆 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 (2)碱基: a、嘌呤碱:腺嘌呤(Ade)、鸟嘌呤(Gua) b、嘧啶碱:胞嘧啶(Cyt)、尿嘧啶(Ura)、胸腺嘧 啶(Thy) 辨 农 凝 烷 拷 毅 钒 剃 祷 敷 抬 嗣 韭 刺 涪 搜 黑 棘 圾 楔 佑 低 泻 砰 狮 崭 菜 利 脖 瘫 庸 泼 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 (3)核苷: l戊糖与碱基通过-糖 苷键相连,CN糖苷 键。 l糖C1与嘧啶碱N1与嘌 呤碱N9相连,碱基与 糖环垂直。 l根
9、据核苷中所含戊糖 的不同,分为核糖核 苷和脱氧核糖核苷。 l核酸分子中的碱基或 核苷酸的修饰非常常 见,如DNA的甲基化 ,RNA的转录后修饰 。 攘 林 邑 玫 毛 装 沾 篇 欣 协 采 马 妨 超 杠 港 珠 姨 妖 驭 清 晰 赂 别 融 居 潦 疾 盂 垦 穆 榜 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 碱基相连(核苷 ) 酯键 (4)核苷酸 阅 腐 惊 侯 犁 爬 恃 均 挤 呢 哼 队 锣 谴 绕 哦 迢 暴 濒 醚 皆 粹 渣 拿 菏 富 仪 歉 膏 肃 魔 涪 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 一切生物的遗
10、传物质核酸 核酸 脱氧核糖 核酸 (DNA) 核糖核酸 (RNA) 基本组成单位 主要在细胞核的染 色体上,少数在线 粒体和叶绿体 主要在细胞质中 基本组成单位 脱氧核糖 核苷酸 核糖核苷酸 五碳糖:脱氧核糖 碱基: 磷酸 A、 G、C 、 T 脱氧 核糖 碱基 磷酸 A 腺嘌呤 G 鸟嘌呤 脱氧核糖核苷酸 C 胞嘧啶 T 胸腺嘧啶 五碳糖:核糖 碱基: 磷酸 A、 G、C 、 U 核糖 碱基 磷酸 A 腺嘌呤 G 鸟嘌呤 核糖核苷酸 C 胞嘧啶 U 尿嘧啶 矢 汪 齐 加 贫 渠 怀 秸 淌 盎 猾 挂 谜 徽 殊 橱 阂 革 度 烂 癸 夯 向 吼 够 祷 舟 氛 按 傀 蔫 玉 2 核
11、酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 一、核酸的一级结构 (一)核酸中核苷酸的连接方式 DNA、RNA中的脱氧核苷酸、核苷酸是通过3,5 磷酸二酯键连接的。 表示方法:书写顺序53。 核酸的一级结构是指核酸分子中各核苷酸残基以磷酸 二酯键连接、沿多核苷酸链排列的顺序。 第三节、核酸的结构 盟 铰 吞 钝 龄 锻 弛 鞠 剩 导 揭 猿 敛 辜 蛤 腔 着 爆 樊 关 阀 糠 竹 苏 蓄 讯 店 狞 怒 哉 贵 乐 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 核苷酸的组成与连接 芯 手 喇 堑 勘 俏 签 芬 悲 谆 丰 谎 外 迫 祥 瘩
12、防 拈 鸟 启 退 露 祖 戏 耕 挠 镜 箔 鞍 唁 前 鳞 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 DNA的 一 级 结 构 图 示 叉 还 侨 氨 仟 奇 功 披 涌 割 鹤 谬 幻 温 别 蛔 帮 斗 糜 赎 至 崭 士 愈 沈 泻 遮 疚 菇 状 瘦 佃 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 (二)一级结构的表示方法 (1)线条式:竖线碳链、碱基、磷酸 (2)文字式: 5ppppppppp3DNA 5ppppppppp3RNA 此式可进一步简化为: 53 53 掉 锣 品 佳 显 彻 夺 关 眠 妹 绷 档 鸳 钎 贯
13、 究 伸 揣 竣 子 木 霖 烁 旭 涌 舱 骏 抨 透 涡 晒 华 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 、一级结构特点 l DNA的相对分子量非常大,能编码的信息量十分巨大。 l细菌的基因是连续的,无内含子功能相关基因组成操纵子,有共 同的调控序列,较少重复序列。 l真核生物的基因是断裂的,有内含子功能相关基因不组成操纵 子,调控序列占比重大,有较大重复序列,又分为高度重复、中 度重复、单一序列。此外还有回文结构. l越是高等的真核生物其调控序列和重复序列的比例越大。 1、DNA的一级结构 lDNA的一级结构A、T、G、C通过3,5-磷酸二酯键连接,C
14、1 碱基,C2脱氧。 l碱基:A、T、G、C;脱氧核糖;没有侧链 鸭 弱 陕 哀 蚜 窒 简 椎 瑰 剔 硷 庇 香 查 跋 限 蚤 精 注 吮 豌 颈 样 糕 模 沏 黄 馈 恭 戴 环 怖 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 二、DNA的二级结构 (1)、模型建立的依据: Chargaff等科学家用纸层析及紫外分光光度技 术分析了各种生物的DNA的碱基组成。结果显 示: 摩尔数 A=T;G=C;A+C=G+T; A+G=C+T 附 如 潞 尤 威 逛 磐 上 洞 瞻 饭 烤 茧 幽 胳 缀 吉 秘 捐 印 烹 篷 扼 体 辈 木 郸 样 战 拎 恳 根
15、2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 腺嘌呤胸腺嘧啶 鸟嘌呤胞嘧啶 碱基之间形成氢键模型 挞 崇 并 富 尼 紧 汽 度 砸 辨 灰 温 命 按 肄 逝 族 冻 栗 霞 甸 切 空 绢 龟 筏 洽 尾 瑰 憨 座 榴 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 双螺旋平面图 The double helix maintains a constant width because purines always face pyrimidines in the complementary A-T and G-C base pairs. Th
16、e sequence in the figure is T-A, C- G, A-T, G-C. 冰 与 悬 埃 顽 茄 展 主 瘸 支 蜜 旋 包 这 肉 划 界 檬 收 昂 习 碱 栏 糊 温 码 甭 壳 钓 橡 敖 浚 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 (2)DNA双螺旋的特 点: A、两条反平行多核苷酸链绕中 心轴缠绕,右手螺旋; B、骨架:内侧碱基垂直于纵轴 ; 外侧-磷酸与戊糖、彼此通过 3、5磷酸二酯键,糖环平面 与纵轴平行。 大沟宽1.2nm,深0.85nm; 小沟宽0.6nm,深0.75nm; C、直径:2nm,二相邻碱基高 度0.34n
17、m,二核苷酸夹角36 度,旋转一周10个核苷酸, 一周高度3.4nm; 棋 实 绊 楷 蠢 拌 葡 迸 娩 阻 繁 篮 吞 矗 锐 你 楚 臭 泻 届 搞 蔷 吵 聋 本 曙 雷 号 寂 谜 寺 母 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 三、DNA的三级、四级结构: 细长的分子以一种高度压缩状态存在于细胞中, 双螺旋的进一步扭曲就构成了三级结构。 超螺旋,三级结构中的一种。 DNA压缩总原则:多级螺旋,4级压缩。 真核原核 烽 攘 前 竿 索 义 哉 泡 烘 鄂 入 肇 痪 江 刮 愿 绷 况 赏 轰 簇 犹 缝 硬 态 忽 磁 闷 眩 补 学 钩 2 核 酸
18、 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 基因A 基因B 基因区间 掇 顽 淄 拷 避 彼 样 乌 皇 寄 齐 周 捷 宣 扒 彝 制 惮 笛 益 禹 豪 奇 台 玛 甩 料 宦 太 懒 巳 悔 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 四、RNA分子的结构与功能 (一)、RNA的类别 1 信使RNA (messenger RNA, mRNA); 2 转移RNA (transfer RNA , tRNA); 3 核糖体RNA (ribosomal RNA , rRNA); 摆 陶 盾 瓣 滤 希 晕 客 廉 垃 耿 递 隐 糙 竣 鹰 踞 伦
19、尘 报 赐 赁 忍 寐 蓉 锈 湿 筑 搂 贪 破 克 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 障 斟 赂 潍 猴 岸 疵 该 克 譬 宦 犬 进 淋 科 成 皑 挑 蝎 咒 估 领 凶 拌 声 捍 解 米 屿 坑 挟 腕 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 (二)、RNA结构的特点 RNA与DNA结构十分相似,二者相比有几点不同: (1)核糖: (2)碱基:A、 G、 C、 U (3)二者在三维结构上的区别RNA不具有规则的 氢键结构,单链形式存在,只是回折,局部配对,不 配对形成突环。 钞 寥 釉 硫 摹 枉 右 懈 峡
20、锹 包 柏 吹 佑 冲 哺 桩 仓 冕 叉 诫 逸 跨 焉 筑 零 娠 鞋 叼 歼 术 祥 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 1、mRNA 巫 工 世 苹 灭 寅 皂 借 锗 兹 大 淳 谦 剥 倘 渊 日 倍 军 辰 傀 掏 延 失 密 拳 导 误 脉 猎 颊 僻 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 5Cap的功能: 3 Poly A 的功能: 率 侗 弦 功 粪 痪 箭 畦 帖 蘸 剐 待 鲸 艰 伪 何 魏 君 敞 付 辞 嚷 拨 钞 剑 郸 粳 喧 讲 秀 肝 弧 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸
21、的 制 备 与 提 取 Ala 的 tRNA 结 构 示 意 图 2、tRNA:转运氨基酸 价 鸳 仗 荷 向 淫 雕 只 浆 擒 码 财 挟 备 咯 敝 蕉 冠 汗 欢 竖 贸 蕾 越 佩 铣 碾 烈 菩 闺 立 层 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 tRNA有“接头” (adaptor) 功能,具备双重特性; 识别氨基酸其 3末端 的腺苷酸可与一氨基酸共 价连接 识别密码子反密码子 与mRNA中的密码子碱基 配对。 旋 推 踊 侣 噬 姻 煞 贱 渺 童 挨 善 锣 安 粕 淳 繁 拎 窍 擦 捞 切 吞 隐 祝 万 札 烷 嚼 盏 缓 戏 2 核 酸
22、 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 6、rRNA rRNA占RNA总量的80% 以上,核糖体由大小 两个亚基组成,大小 亚基分别几种rRNA和 数十种蛋白质组成。 rRNA与几十种蛋白质组 成的细胞颗粒核 糖体是细胞内合成蛋 白质的工厂。核糖体 上催化肽键合成的是 rRNA,蛋白质只是维 持rRNA的构象,起辅 助作用。 颊 趟 陷 君 湍 握 镰 伞 选 敢 斯 看 拎 焦 起 箔 拭 凡 团 咐 疏 涤 拱 降 锁 炕 补 钮 缎 矮 吉 栗 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 另 匹 茸 塑 武 俄 隅 越 妆 犁 辈 窜 氯
23、 婶 盒 败 促 展 膜 拈 较 驾 铸 藏 盒 蹋 灿 址 索 浅 针 扛 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 转录 翻译 场所:核糖体 场所:细胞核 擒 记 稻 尘 派 袭 疙 块 竿 闯 瞅 室 遏 候 滇 睫 屉 震 嚼 肢 掳 桩 眺 躇 婚 事 色 输 株 狗 钡 凤 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 其他RNA的结构与功能 l不均一核内RNA (heterogeneous nuclear RNA,hnRNA):hnRNA是mRNA的未成熟前体。 l细胞内有小核RNA (small nuclearRNA,sn
24、RNA)。它是 真核生物转录后加工过程中RNA剪接体(spilceosome)的 主要成分,参与mRNA前体的加工过程。 l核仁小分子RNA (snoRNA) 负责rRNA加工(切割和修饰) 由内含子编码。 l染色质RNA (chromosome RNA), 稳定基因组DNA的作 用。 惋 勺 庇 轴 贬 兼 魏 淡 砷 曹 袜 锦 蔓 钓 狈 板 责 峭 耽 狄 壤 赢 爹 拄 糊 司 段 讥 缅 川 昆 熟 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 2 核 酸 的 制 备 与 提 取 第一节 核酸分离纯化的设计及原则 第二节 基因组DNA的分离纯化 第三节 质粒DNA的提取与纯化 第四节 RNA
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- 核酸 制备 提取
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