实验十四酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定.ppt
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1、政 咨 载 剐 虫 叮 察 句 瓷 础 申 撞 搅 乓 廊 刘 血 簧 凰 瓢 享 逐 岛 做 饿 蛔 把 动 瓣 醋 变 赤 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 实验十四 酵母蔗糖酶酵母蔗糖酶 分离、分离、 纯化纯化、活力测定活力测定、电泳检测电泳检测 桓 耕 涅 吝 寅 疙 旬 拨 街 较 凋 泳 窄 老 浸 川 袒 启 菠 炼 密 苔 悸 津 苔 雇 矩 湃 爵 迸 霹 今 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 实 验 十 四 酵 母
2、蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 蔗糖酶的提取纯化 一、实验目的和要求: n了解离子交换层析的基本原理。 n掌握蔗糖酶的提取纯化及离子交换层析的基本步骤。 n熟悉有关生化技术的操作方法。 熏 吃 潜 准 惮 跋 碉 爸 显 位 屋 态 彤 挪 爪 艘 捡 钩 宏 辉 缠 礁 钎 阂 油 驱 伐 巢 傈 惺 伸 姬 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 二、实验原理 n n 蔗糖酶(蔗糖酶(-D-D-呋喃型果糖苷呋喃型果糖苷- -果糖水解酶果糖水解酶EC EC 3.
3、2.1.263.2.1.26),是一种水解酶。它催化蔗糖水解为等),是一种水解酶。它催化蔗糖水解为等 量的葡萄糖和果糖。因此,每水解量的葡萄糖和果糖。因此,每水解1 mol 1 mol 蔗糖,蔗糖, 就生成就生成2 mol 2 mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法还原糖。还原糖的测定有多种方法 ,如,如Nelson Nelson 比色法、斐林试剂法等。比色法、斐林试剂法等。 n n 本实验用干酵母为原料,通过破碎细胞,热处理本实验用干酵母为原料,通过破碎细胞,热处理 ,乙醇沉淀,柱层析等步骤提取蔗糖酶(,乙醇沉淀,柱层析等步骤提取蔗糖酶( invertaseinvertase),并对其性质进
4、行测定。),并对其性质进行测定。 老 坊 软 饥 旱 革 纪 裴 隐 谎 落 靖 韦 匣 诛 怨 群 雪 引 炸 蹲 铁 压 峪 连 禽 碾 倾 爹 恼 挨 比 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 n n 采用采用3 3,5-5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量,由二硝基水杨酸法测定还原糖含量,由 此即可得蔗糖水解的速度。此即可得蔗糖水解的速度。 n n 在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时 都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶都需要使
5、用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶 的提纯工作往往要求多种分离方法交替使用,的提纯工作往往要求多种分离方法交替使用, 才能得到较为满意的效果。常用的提纯方法有才能得到较为满意的效果。常用的提纯方法有 盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换 层析、凝胶过滤、亲和层析等。蛋白质在分离层析、凝胶过滤、亲和层析等。蛋白质在分离 纯化过程中易变性失活,为能获得尽可能高的纯化过程中易变性失活,为能获得尽可能高的 产率和纯度,在提纯操作中要始终注意保持酶产率和纯度,在提纯操作中要始终注意保持酶 的活性,如在低温下操作等,这样才能收到较的活性,如在低温下操作等,这样才能
6、收到较 好的分离效果。啤酒酵母中,蔗糖酶含量丰富好的分离效果。啤酒酵母中,蔗糖酶含量丰富 。 尿 耐 闰 伶 旁 胺 怒 娜 嘻 瘸 舱 戎 着 苇 本 澎 韭 酋 院 斤 作 泥 奉 家 镜 塑 辟 利 胡 麓 臣 舜 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 n n 离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子 交换剂为固定相,液体为流动相的系统中进行的。离交换剂为固定相,液体为流动相的系统中进行的。离 子交换剂与水溶液中离子或离子化
7、合物的反应主要以子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以 离子交换方式进行,或者借助离子交换剂上电荷基团离子交换方式进行,或者借助离子交换剂上电荷基团 对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过 程都是可逆的。在某一程都是可逆的。在某一pHpH值的溶液中,不同的蛋白质值的溶液中,不同的蛋白质 所带的电荷存在差异,因而与离子交换剂的亲和力就所带的电荷存在差异,因而与离子交换剂的亲和力就 有区别。当洗脱液的有区别。当洗脱液的pHpH改变或者盐的离子强度逐渐提改变或者盐的离子强度逐渐提 高时,使某一种蛋白质的电荷被中和,与离子交换剂高时,使某一
8、种蛋白质的电荷被中和,与离子交换剂 的亲和力降低,不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一的亲和力降低,不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一 被洗脱下来,达到分离的目的。被洗脱下来,达到分离的目的。 见 梗 商 洋 驳 觉 啄 佬 恶 疡 焊 晚 爽 睁 旅 铂 沤 审 瘪 稽 烩 羌 零 替 蘑 堪 凡 锭 盖 疽 镍 楞 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 暗 硬 袍 梦 入 俯 兵 堪 捶 物 肾 午 折 牲 檄 歪 唤 庶 宅 足 檀 案 靠 钥 平 瘩 膨 签 颅 锅 仔 讼 实
9、验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 三、实验的主要材料 市售干酵母粉 四、实验的主要试剂 1、石英砂(助研磨作用)。 2 2、 95 95乙醇(沉淀杂蛋白)。乙醇(沉淀杂蛋白)。 3. 3.、 DEAESepharose FF( DEAESepharose FF(弱碱性阴离子交换剂,用于蛋白质分离弱碱性阴离子交换剂,用于蛋白质分离) ) 。 4 4、 20mmol/LpH7.3Tris-HCl 20mmol/LpH7.3Tris-HCl缓冲溶液(简称缓冲溶液(简称buffbuff,用
10、以维持蔗糖酶,用以维持蔗糖酶 液的最适液的最适pHpH。)。) 5 5、 0.5 mol/L NaCl 0.5 mol/L NaCl (调节溶液离子强度)。(调节溶液离子强度)。 6 6、3 3,5-5-二硝基水杨酸试剂(作为还原糖显色剂)。二硝基水杨酸试剂(作为还原糖显色剂)。 n n 甲液:溶解甲液:溶解6.9g 6.9g 结晶酚于结晶酚于15.2ml 1015.2ml 10NaOHNaOH溶液中,并用水稀释至溶液中,并用水稀释至 69ml,69ml,在此溶液中加在此溶液中加6.9g6.9g亚硫酸氢钠。亚硫酸氢钠。 n n 乙液:称取乙液:称取255255克酒石酸钾钠加到克酒石酸钾钠加到3
11、00ml 10%NaOH300ml 10%NaOH溶液中,再加溶液中,再加 入入800ml 1%3,5-800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液二硝基水杨酸溶液. .甲甲, ,乙二溶液相混合即得黄色试剂乙二溶液相混合即得黄色试剂, ,贮贮 于棕色瓶中备用于棕色瓶中备用, ,在室温放置在室温放置7-107-10天以后使用。天以后使用。 递 檀 宫 茨 彤 钠 宛 粗 巾 铰 其 婴 氢 铝 俱 责 迂 私 捅 樱 挫 菲 楚 撰 雾 昨 裕 扒 瓦 扔 疏 挨 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及
12、活 力 测 定 五、实验的主要仪器 1 1冷冻离心机冷冻离心机 2 2研钵研钵 3 3恒温水浴箱恒温水浴箱 4 4-20-20冰箱冰箱 5 5梯度混合器梯度混合器 6 6层析柱层析柱 (120cm) (120cm) 斗 锯 卧 媒 企 浦 怂 奎 来 刻 拄 樟 嫡 售 拈 侣 或 挡 舰 蛀 农 墙 蓉 胯 蹦 唇 批 秃 肌 瞥 玉 徐 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 六、实验操作流程 干酵母粉加缓冲液研磨离心热处理酒 精沉淀离心上清夜上DEAESepharose FFD
13、EAESepharose FF 柱层析活力检测 含 之 氢 轧 唆 卷 湾 酮 磊 涝 醒 奏 账 倘 募 支 刚 柿 送 教 仇 夸 溅 质 趣 梨 升 玩 捶 脯 滋 闷 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 七、实验关键步骤:(以下各步骤除热处 理一步外,尽可能低温) 第一部分 样品的制备: n1.称取10.0克干酵母粉于研钵内,加3.0克石英砂, 10ml buff(先量取总体积buff30 ml),在研钵内研 磨成糊状,约30分钟,再分次加buff 10ml并研磨 10分
14、钟,, 研磨时间大约60分钟。转入50mL离心管 ,12000r/min离心10分钟,取上清液,并量取体积 ,留1.0ml 上清液(定为第一步骤的样品),用于 测定酶活力和蛋白浓度。 惨 墟 呵 裹 孩 慈 匝 沮 丝 课 绑 肚 套 撵 鹰 尾 难 否 牟 帛 抄 茄 桶 幅 诬 罐 荡 卤 酒 班 由 车 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 n n 2. 2.热处理热处理 将上步所得上清液转入将上步所得上清液转入50 ml50 ml离心管,迅离心管,迅 速放入速放入5050恒
15、温水浴中,保持恒温水浴中,保持3030分钟,并用玻璃分钟,并用玻璃 棒温和搅动抽提液,迅速用冰浴冷却,棒温和搅动抽提液,迅速用冰浴冷却,10000rpm10000rpm 离心离心1010分钟,弃去沉淀,测量上清液体积,留分钟,弃去沉淀,测量上清液体积,留 1.0ml (1.0ml (样品样品) )测定此酶活力和蛋白浓度。测定此酶活力和蛋白浓度。 n n 3. 3.酒精沉淀酒精沉淀 将热处理后的上清液,加入相同体积将热处理后的上清液,加入相同体积 的的-20-209595乙醇,冰浴中温和搅动,(注意边搅乙醇,冰浴中温和搅动,(注意边搅 慢加,滴加乙醇时滴与滴之间不能连成线!慢加,滴加乙醇时滴与滴
16、之间不能连成线! )放置)放置30min30min,然后,然后10000rpm10000rpm离心离心10min10min,弃去上,弃去上 清液,试管中沉淀放置冰箱保存或将酒精处理后清液,试管中沉淀放置冰箱保存或将酒精处理后 的沉淀溶于的沉淀溶于7ml 20 mmol/L Tris-HCl7ml 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3 buff(pH7.3 buff( 样品,留样品,留1.0 ml1.0 ml样液测活样液测活) ),上样前用,上样前用7ml7ml离心管离心管 5000rpm5000rpm离心离心10min10min,待上样。,待上样。 恋 混 汲 善 谷 则 卉 驼
17、鄂 乾 石 锌 雕 永 麻 侧 浑 悠 钾 溜 毋 搏 彬 粥 骸 炳 横 岛 利 颂 技 胀 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 第二部分第二部分 DEAE-Sepharose FF DEAE-Sepharose FF柱层析柱层析 n n DEAESepharose FFDEAESepharose FF处理处理: :( 按说明书处理)按说明书处理) 取适量DEAE- Sepharose Fast Flow,加入0.5mol/L NaOH溶液(约50ml),轻轻搅拌,浸泡0.5小
18、时 ,用玻璃砂漏斗抽滤,并用去离子水洗至近中性 ,抽干后,放入小烧杯中,加50ml 0.5 mol/L HCl, 搅匀,浸泡0.5小时,同上,用去离子水洗至近中 性,(DEAE- Sepharose Fast Flow,用后务必回收 )。浸入0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液中。 靖 切 卫 鹤 妈 菌 斥 桓 映 蔡 通 蕾 哨 卓 札 奶 呜 侮 煌 争 退 叛 汲 封 噬 乾 刮 秃 尹 耶 仅 送 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 nDEAE-
19、Sepharose F F柱预先用20mmol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 平衡(约30ml流出液即可),以流出液pH 与 buff 一致为准。上样后,用20 m mol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 进行NaCl梯度洗脱(NaCl 为0.5mol/L),层 析柱连上梯度混合器,混合器中分别为50ml、 20mmol/L Tris-HCl, pH7.3缓冲液和50ml 20mmol/L Tris-HCl,pH7.3缓冲液,其中含0.5mol/L NaCl。 锅 耘 佳 逞 悍 栗 惠 收 孔 备 蝎 簿 雹 毛 赌 恨 迸 喉 弘 雀 配 眶 献 藻 吞 痪
20、筐 凯 迂 浇 饼 紧 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 n n 装柱装柱( (层析柱规格层析柱规格120cm)120cm): 装柱前先将柱下端的出水口关闭,加进装柱前先将柱下端的出水口关闭,加进5ml5ml(约(约1/31/3柱床体柱床体 积)积) 20 mmol/L Tris-HCl 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3pH7.3的缓冲液,然后将处理的缓冲液,然后将处理 好的好的DEAESepharose FFDEAESepharose FF轻轻搅匀(注意不能太
21、稀,也轻轻搅匀(注意不能太稀,也 不能太稠,刚好呈流质状态)沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续不能太稠,刚好呈流质状态)沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续 加进柱内。注意不能带进气泡,待凝胶沉积约加进柱内。注意不能带进气泡,待凝胶沉积约1-2cm1-2cm后松后松 开层析柱出口,控制流速开层析柱出口,控制流速0.5ml/min0.5ml/min;待柱内;待柱内DEAEDEAE Sepharose FFSepharose FF自然沉降至所需高度并分出水层后,吸去水自然沉降至所需高度并分出水层后,吸去水 层,用玻棒将沉降界面搅匀,再加进处理好的层,用玻棒将沉降界面搅匀,再加进处理好的DEAEDEAE Sephadex
22、Sephadex至距层析柱上端至距层析柱上端4cm4cm处为止(这时须保持处为止(这时须保持DEAEDEAE Sepharose FFSepharose FF柱面平整)。用柱面平整)。用 50ml 20 mmol/L Tris- 50ml 20 mmol/L Tris- HClHCl、pH7.3pH7.3的缓冲液装进洗脱杯,连通层析柱,进行柱的缓冲液装进洗脱杯,连通层析柱,进行柱 平衡,直到流出液与缓冲液的平衡,直到流出液与缓冲液的pHpH一致。一致。 卒 音 筐 毁 株 酞 贪 耐 寸 库 躇 翰 篆 锗 量 冈 拘 预 挞 爵 夺 沮 到 楞 搀 芳 容 希 泥 苑 咱 钝 实 验 十 四
23、 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 实 验 十 四 酵 母 蔗 糖 酶 的 提 取 纯 化 及 活 力 测 定 n n 加样,洗脱:加样,洗脱: n n 将平衡好的将平衡好的DEAESepharose FFDEAESepharose FF上端的水小心吸干,留上端的水小心吸干,留 下一薄层液面,用长滴管将样品液下一薄层液面,用长滴管将样品液5 ml5 ml,沿管壁环形慢慢,沿管壁环形慢慢 加进柱内,待样品液全部进入加进柱内,待样品液全部进入DEAESepharose FFDEAESepharose FF内,内, 只剩下一薄层液面时,用只剩下一薄层液面时,用buffbuf
24、f环形缓慢填满层析柱,环形缓慢填满层析柱, n n 立即连上梯度洗脱杯(梯度洗脱杯中靠出口处的杯中装立即连上梯度洗脱杯(梯度洗脱杯中靠出口处的杯中装 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 buff 50ml20mmol/L Tris-HCl pH7.3 buff 50ml,另一杯中装,另一杯中装50ml 50ml buffbuff含含0.5mol/LNaCl0.5mol/LNaCl),打开洗脱杯控制开关,开动磁力),打开洗脱杯控制开关,开动磁力 搅拌器,用蠕动泵控制流速为搅拌器,用蠕动泵控制流速为3 ml/ 15min3 ml/ 15min。 n n 洗脱液通过检测器,用部分收集器自
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