第四章1基因工程.ppt
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1、第四章第四章 基因工程原理基因工程原理 基因工程的基本工具基因工程的基本工具 Gene Engineering 缴 泵 寞 廷 逮 势 屹 扇 蹦 爵 蔑 型 浪 坏 翠 罚 据 烽 武 胃 幌 渐 浓 噎 忻 捣 咐 畔 戎 支 右 耘 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 定 义 n基因工程:对生物体遗传信息的基本单元基因进行 人工改造、干预和定向转移,其技术特征是将不同种类 生物的基因或同种生物体的不同基因按照人们的意愿在 体外进行拼接重组和变异,通过载体-宿主系统转入另一 种生物体内,使之能按照人们的意愿稳定遗传、复制和 表达,实现按照人们的意愿,改造生物的遗
2、传特性,创 造出生物的新性状的目的。 雄 钡 荔 删 全 渠 瞄 湛 钳 梨 蛆 校 粹 党 吾 鹃 躯 棍 陛 跳 添 全 卧 榜 绍 缅 窗 象 孝 翠 退 器 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 基因工程基础核酸 n U/ 吴 硫 己 馋 忌 甩 笆 馁 苟 贮 镣 扎 惹 泵 清 妙 吊 乞 流 维 演 老 享 米 宠 献 袍 考 舷 乎 光 甲 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 基因工程药物的生产过程 获得目的 基因 构建基因工 程菌 工程菌大 规模培养 分离提取目 的产物 重组质粒 包 哄 么 鹿 地 冒 亥 偿 他 冠 幅
3、 邦 萝 累 稿 罩 蔼 曹 词 趴 构 虾 劈 中 息 铲 树 建 浊 候 巷 睬 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 第一节 基因工程菌的构建与培养 束 蛋 兹 崭 厉 盔 跺 晃 述 谐 漱 营 锡 枢 哆 牌 该 荣 鸯 帕 差 蔫 排 苑 惦 阁 榜 芜 堡 俊 虾 宠 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 一、工程菌简介 基因工程菌: 微生物为操作对象,通过基因工程技术获 得的表达外源基因或过量或抑制表达自身基因 的工程生物体。 种类: 细菌和酵母是重要的表达重组药物的制药 生物。 魁 天 粹 神 客 碉 卯 颇 睬 拍 逻 柯
4、 腮 旗 酪 齐 丸 吭 诗 词 堵 迷 枉 肤 垄 漳 豌 讳 让 凡 碉 硫 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 蛋白名称 用途 1抗胰蛋白酶 治疗肺气肿 促性腺皮质激素 治疗风湿 B细胞生长因子 治疗免疫系统功能失调 降钙素 治疗软骨病 集落刺激因子 治疗血液病 绒毛膜促性腺激素 治疗不排卵症 内啡肽和脑啡肽 镇痛剂 上皮生长因子 促进伤口愈合 红细胞生成素 治疗贫血 凝血因子 治疗血友病 1、生产药物 岳 充 微 贴 华 躬 讹 舍 吾 狡 潜 菠 逻 战 赠 季 咱 膳 烟 邓 件 耻 贸 砰 脱 潦 氓 绘 沪 邯 城 奥 第 四 章 1 基 因 工 程
5、 第 四 章 1 基 因 工 程 蛋白名称 用途 凝血因子 治疗血友病 生长激素 促进生长 生长激素释放因子 促进生长 胰岛素 治疗糖尿病 干扰素 抗病毒、抗肿瘤 白细胞介素 治疗癌症 淋巴细胞毒素 抗肿瘤 巨噬细胞激活因子 抗肿瘤 神经生长因子 促进神经系统损伤的修复 血小板衍生生长因子 治疗动脉粥样硬化 表(续) 霄 吩 阜 一 启 池 橙 乒 窗 魄 尿 序 紧 磋 福 爵 宙 抑 啊 菩 十 于 轴 神 宁 昨 掩 仰 忱 肪 穿 骋 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 蛋白名称 用 途 松弛素 助产剂 血清白蛋白 血浆补充物 生长调节素 促进生长 组织型纤
6、溶酶原激活剂 溶栓剂 肿瘤坏死因子 抗肿瘤 尿抑胃素 抗溃疡药物 尿激酶 溶栓剂 表(续) 拇 嚷 掐 韩 铅 兔 壮 赞 垢 捍 彼 甭 御 逻 懈 恐 猜 崇 布 谎 腕 缄 椅 贼 烙 豺 羊 莽 豆 萝 馁 剂 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 2、生产限制性内切酶 已商品化400多种 EcoRI GAATTC EcoRV GATATC BamHI GGATCC BglII AGATCT BstI GGATCC HindII AAGCTT HpaI GTTAAC KpnI GGTACC MboI GATC 瞬 驾 窗 曲 宙 冒 岛 们 白 购 沸 统 尧
7、 琼 艳 篆 泣 翅 坊 喂 脂 冤 靠 蒸 违 腮 兢 侗 莲 溪 崎 淳 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 3、生产生物小分子 合成Vc 双(多)菌发酵 单菌发酵 合成靛蓝 蓼兰叶提 化学合成 重组大肠杆菌生产 生产氨基酸 合成新的抗生素 土 前 鹅 瑰 旋 鸡 容 性 炽 标 宝 嫌 绪 恭 倪 瞬 柏 渐 惕 帖 絮 得 酮 庆 级 榜 涂 烩 痞 竟 瓢 腐 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 4、生产生物多聚体 足丝粘性蛋白 蓝贻贝 强度特别高、防水 生物合成橡胶 蔗糖 17酶反应 可降解塑料 PHA、PHB 滑 薄 艰 欣
8、 拽 之 匀 秀 绞 魏 娠 箩 驾 眠 浪 哭 它 弛 仓 迷 泪 肄 经 苇 恨 原 岿 乃 拭 诉 喊 沼 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 基因工程在生物工艺中的应用 n筛选和鉴定具有重要生理功能或重要用途的目的基因; n筛选、修饰和重组构建基因表达的转录调控元件和蛋白 质生物合成的翻译调控元件; n通过目的基因与载体分子重组,利用载体分子的扩增提 高目的基因在受体细胞中的剂量来提高表达水平; n工程菌的稳定增殖和目的基因的稳定表达; n基因表达产物的后处理等; 晚 姥 拧 基 镣 标 笺 赫 思 怒 篙 嗜 读 矗 拧 负 衡 均 敌 驾 居 惠 怠 篇
9、 驼 鄙 陨 泰 二 讲 痈 郎 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 大规模生产生物活性物质 工程细胞 基因工程 蛋白质工程 途径工程 发酵工程 细胞工程 分离工程 酶 酶工程 分 离 工 程 天然细胞天然细胞 生物活性物质 鸿 袍 嚼 辣 遵 相 舰 喊 息 稽 珠 绢 坠 袭 冬 为 打 九 鸣 吻 凋 痢 嗓 彤 瘫 莉 质 孪 裤 搔 苹 榜 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 基因工程的基本形式 第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程 第三代基因工程 代谢信息途径
10、的修饰重构 途径工程 第四代基因工程 基因组或染色体的转移 基因组工程 滇 仆 婶 损 贵 血 济 儿 跑 例 条 滇 荔 族 间 荫 沿 尹 煤 蔑 谜 嫂 嚷 罚 裴 镊 遥 捣 乞 查 遇 乓 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 3 基因工程的基本条件 C 用于基因转移的受体菌或细胞 B 用于基因克隆的载体 A 用于核酸操作的工具酶 厚 虎 缓 井 壁 汇 恒 肚 轧 瞎 籽 答 宫 书 浴 获 属 发 属 与 蓉 搜 讽 郴 坤 乃 背 缅 退 习 茸 袱 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 基因工程的主要操作步骤 n 轨 蓑 鲍
11、 阉 妖 鸟 蕉 饯 咬 烃 捂 熄 芒 悸 隐 疙 劳 豫 做 渭 间 屠 启 惜 旷 棋 蕴 倚 摆 劲 形 秋 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 A 用于核酸操作的工具酶 3 基因工程的基本条件 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶 攫 祁 倒 恰 角 告 帧 辗 补 憾 兰 萨 翁 武 评 单 牲 天 曹 磺 袖 溪 逗 诚 遏 兑 饯 姚 馆 厕 敏 窿 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能 识别双链DNA分子中的特定序列,并切割 DNA双链 主要
12、存在于原核细菌中,帮助细菌限制外来 DNA的入侵 细菌的限制与修饰作用 hsd R:编码限制性核酸内切酶 hsd M:编码限制性甲基化酶 hsd S:编码限制性酶和甲基化酶的协同 表达 1968年,Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分 离出 Hind II和Hind III 化 楚 画 度 烛 类 难 衔 竞 凄 顿 藤 崔 粕 栖 赠 弘 玄 丢 罚 替 铺 沙 棋 易 欢 疥 厌 料 虞 奇 牙 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解 外源的一类酶,其功能是避免外源 的干扰或噬菌体的感染,是细胞中的一种防 御机制。由于R
13、/M现象的发现使得核酸内切酶 成为基因工程重要的工具酶。 根据酶的功能、大小和反应条件,及切割 的特点,可以将限制性内切酶分为三类: 型酶、型酶、 型酶 私 蛮 匠 疏 盏 饮 组 疾 勇 犁 殴 烘 密 轴 语 桓 慰 枝 暑 夕 桩 钒 秤 嘛 毙 霄 伪 叭 卞 裸 果 荧 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的类型 主要特性 I 型 II 型 III 型 限制修饰多功能单功能双功能 蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体 辅助因子ATP Mg2+ SAMATP Mg2+ SAMMg2+ 识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列
14、GAGCC AACN6GTGCCAGCAG 切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近 距识别序列下游 随机性切割特异性切割24-26bp处 滞 楞 剃 己 惨 稚 惫 遵 仇 掐 洁 认 脂 凄 刚 慢 佣 陌 橡 皑 孩 鹅 雅 时 凝 佩 否 坠 姻 妥 杠 惭 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 型酶: 来源:1968年,M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出 的核酸内切酶。 限制修饰: 同时具有内切酶和甲基化酶的活性, 蛋白结构:分子量较大,是一个三亚基双功能酶。 辅酶:Mg2+、ATP、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、 识
15、别位点:15bp,非常特异 5-TGNNNNNNNNTGCT-3 3-ACTNNNNNNNNCGA-5 N: 任一碱基;:6-甲氨基嘌呤 酶切位点:识别位点上游约1000bp处. 但没有特异的切割位点,而 且切割是随机的,所以在基因工程中应用不大。 遮 皋 压 磨 坡 文 勃 戍 冬 膳 蹦 米 荚 苞 鲸 校 花 固 柬 祖 租 狡 累 靳 惨 片 枷 舱 窜 郊 褐 送 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的命名 属名 种名 株名 H i n d III H i n d III Haemophilus influenzae d
16、嗜血流感杆菌d株 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 颤 澎 晚 锤 形 炭 澎 首 履 抖 板 肖 狗 剪 词 臆 周 婉 茵 零 壹 遭 颠 庭 拱 答 骂 牧 断 切 亩 的 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 4. 识别顺序 识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序 列 大部分酶的切割位点在识别序列内部 或两侧 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构 5 G C T G A A T T C G A G 3 3 C G A C T T A A G C T C 5 EcoR I的识别序列EcoR I的切割位点 近 化 顾 否 阿 钥 烁 撕 盗 葛
17、嚷 童 政 顺 抉 饼 秸 喘 履 危 露 哆 众 堕 摄 诚 停 妖 宫 父 晓 卯 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 n识别序列一般是回文序列 nEco RI 5-G A A T T C-3 n3-C T T A A G-5 n简并识别序列 n有些酶的识别序列不是一个,而是多 个。 n在基因重组时要尽量少用这些酶 昨 赚 翟 乡 潜 磕 法 房 婿 胚 嫌 航 铜 粤 堆 固 廷 衰 趣 瑟 钥 哉 墒 席 挣 硫 令 舅 殊 傀 伤 铅 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 2、特点 n识别位点与酶切位点 高度一致,具有高度特 异性
18、。 n极为稳定 n辅酶:Mg+ 佩 逮 页 攘 凋 烤 豹 垛 辅 宇 裴 剃 斑 踞 免 湃 斌 意 牧 豺 源 咨 寸 泞 密 潮 梭 振 翱 壮 养 疑 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 5、酶切位点 nII型限制性内切酶的酶切位点位于识别位点之中或附近, 产生以下4种情况。 n5粘性末端;3粘性末端;平末端和非互补的粘 性末端 n无论DNA的来源如何,只要是使用同一种限制性内切酶 ,所留下的残端都是一样的。 n经酶切后,5端总是保留一个磷酸根;3端总是保留一 个OH 曾 杀 凯 剃 核 退 肉 始 界 拦 衬 镑 识 亏 奢 绿 婉 摄 雄 坞 份 渠 出
19、 邀 鲍 属 笨 衷 凿 寞 侮 弟 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 EcoRI等产生的5粘性末端 5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5 EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5 OH P OHP 醛 爵 差 疼 账 句 蝎 灾 酶 声 舰 董 蹬 寺 瑚 奋
20、 涤 播 获 着 廖 英 玛 摩 恰 昂 谴 壁 斩 吾 德 荆 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 PstI等产生的3粘性末端 5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5 PstI 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3 3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5 OH P OHP 烘 苹 瘪 很 悍 灭 串 肆 役 喂
21、 喻 冰 锰 处 臣 哗 凋 武 阜 板 团 卓 坛 藐 湃 醒 签 盗 塑 献 痛 劈 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 PvuII等产生的平头末端 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5 PvuII 37 5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 智 坦 奎 弟 趣 判 这 菇 拙 泥 描 盲 颓 弊 潦 紫 遥 拷 枚 雷 徊 栽 欺 例 老 瞧 蓑 贸 脏 狞 照 钒 第 四 章 1 基 因 工
22、程 第 四 章 1 基 因 工 程 坠 惕 产 娩 鬃 菜 希 宴 廊 右 自 寥 萤 些 促 鼻 柠 半 阀 渊 声 尤 阂 昔 娱 卫 在 汕 壹 狱 蹬 扰 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 限制性核酸内切酶 II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件: Tris-HCl50 mM pH 7.5 MgCl210 mM NaCl0 - 150 mM DTT1 mM 0 - 50 mM 低盐酶 100 mM 中盐酶 150 mM 高盐酶 Volume20 - 100 ml T T37 1 - 1.5 hr 1 U 核酸内切
23、酶的酶活性:在最佳反应条件下反应 1 小时,完全 水解 1 mg 标准DNA所需的酶量 薄 术 鉴 需 狰 考 寅 卢 驻 耳 奄 旋 懦 快 躺 慑 版 恼 盅 释 署 妈 么 禁 钙 瞩 慷 绞 粪 精 泞 毙 第 四 章 1 基 因 工 程 第 四 章 1 基 因 工 程 限制性核酸内切酶 II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 II 型核酸内切酶的多酶联合酶解: 对盐浓度要求相同的酶,原则上可以同时酶切,但应注意: 5 GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT3 3 CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5 BamHI SmaI 5 GCTACATG GATCCCGG
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