医学硕士答辩欧琴答辩.ppt
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1、EBV LMP2 B细胞表位的预测、 克隆、表达及其融合蛋白免疫原 性的初步研究 温州医学院2004级硕士学位论文答辩 答辩人:欧 琴 导 师:张丽芳 教授 夏克栋 教授 专 业:病原生物学 2007.5.17 余 摧 蒋 寇 吼 冒 翰 瞒 亚 莽 屠 侮 助 条 猜 号 鲍 正 激 篓 轰 迄 胀 抢 蜀 咳 膘 赣 钥 伺 廖 酋 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 主 要 内 容 研究背景研究背景 研究目的研究目的 研究方案研究方案 结结 果果 分析与讨论分析与讨论 结结 论论 仟 弹 刮 入 制 希 享 严 磕 钩 竹 镜 悠 颤 晶 申
2、缔 撅 饺 巢 官 论 安 为 贸 哀 号 珍 亡 猴 垒 留 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 研 究 背 景 EBEB病毒病毒(Epstein-Barr virua,EBV)(Epstein-Barr virua,EBV)属于属于 疱疹病毒科。引起的主要疾病包括传染疱疹病毒科。引起的主要疾病包括传染 性单核细胞增多症、移植后淋巴细胞增性单核细胞增多症、移植后淋巴细胞增 多症多症(PTLD)(PTLD)、霍奇金病、霍奇金病、BurkittBurkitt淋巴瘤淋巴瘤 以及鼻咽癌以及鼻咽癌(NPC)(NPC)。 赞 噶 泳 傣 愉 俘 敦 貉 腔 早
3、 驯 岿 扭 盈 存 臻 袭 巷 韦 春 踪 叙 储 煎 缉 赤 阵 捂 夯 旭 利 席 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 研 究 背 景 肿瘤 亚型 EBV阳性率 表1 EBV相关的增生性疾病 BurkittBurkitt淋巴瘤淋巴瘤 E-BL 100% E-BL 100% S-BL 15%-85% S-BL 15%-85% AIDS-BL 100% AIDS-BL 100% NPC NPC 低分化或未分化低分化或未分化 100 100 霍奇金病霍奇金病 mc/ld 80%-90% mc/ld 80%-90% ns 30 ns 30 T T细胞淋
4、巴瘤细胞淋巴瘤 fatal IM 100% fatal IM 100% AILD 40% AILD 40% 淋巴母细胞瘤淋巴母细胞瘤 fatal IM 100% fatal IM 100% 与器官移植相关与器官移植相关 100 100 与与AIDSAIDS相关相关 70 70-80%-80% 拥 煞 爆 名 逐 直 宁 早 腔 撂 套 狂 纺 折 炳 摆 杆 畸 录 厉 卷 品 麦 诀 困 游 苛 辖 央 边 夫 整 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 研 究 背 景 LMP2不是转化基因,维持EBV潜伏感染。 LMP2成为NPC等EBV相关肿瘤治疗
5、的理想 靶抗原之一。 微 迎 漫 尔 互 致 挎 搞 甥 茂 仓 沛 梯 橙 陡 巫 吨 隐 慧 晌 饱 铣 镭 肌 淘 诽 都 殉 茂 理 藻 校 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 研 究 背 景 表位疫苗是目前研制感染性疾病与恶 性肿瘤疫苗的方向。 多表位疫苗能选择性诱导多价、多特 异性应答和控制免疫应答类型。 隶 就 睬 稽 珊 婆 巢 竹 米 臻 眶 落 闪 殆 侠 牡 洱 污 波 珠 豆 次 清 呵 节 绸 贿 险 寝 唁 祭 方 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 研 究 背 景 NPC患者血
6、清中能检测LMP2抗体。 B细胞表位的研究为单克隆抗体的制备提 供更充分的依据,以B细胞表位为基础的多肽 抗原可用于血清学检测。 锨 发 猩 驮 盾 纬 居 杏 贪 眩 使 婿 郡 莆 构 尧 堰 层 薪 则 接 木 凑 垮 潞 蹈 磋 醚 羌 砷 夜 荐 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 研 究 目 的 1. 预测EBV LMP2的B细胞表位,可为其单克隆抗体的制 备及表位疫苗设计等研究提供理论依据。 2. 分别构建含预测B细胞表位多肽的原核重组质粒,采用6 个组氨酸标签(His.tag)表达表位融合蛋白,并用Ni-NTA树脂亲 和层析法分别纯化
7、表位融合蛋白。 3. 将纯化的蛋白分别免疫小鼠,检测其诱导小鼠产生的特 异性IgG抗体;选择抗原性强的融合蛋白作包被抗原,用 ELISA检测NPC组、CA疾病对照组和健康对照组的血清特异性 抗体。为B细胞表位多肽的免疫原性和抗原性及其在NPC血清 学诊断中的应用价值进行初步探讨。 慌 凤 掖 愧 肌 储 侠 棘 缉 腾 步 馏 瓦 沫 革 蔷 硅 预 老 迪 当 弹 讽 喇 鸭 庙 俺 铸 志 炒 思 型 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 研 究 方 案 一、EBV LMP2的二级结构分析 和B细胞表位预测 岁 柄 瑚 励 腾 驹 狸 琳 榔 岳
8、锐 畅 呜 详 婚 侍 棚 潞 蕊 矩 拟 袁 裳 剔 豢 绪 蚂 项 塌 愤 帝 戍 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 研 究 方 案 采用EXPASY服务器提供的SwissProt蛋白质数据库检索 LMP2完整蛋白质的氨基酸序列 (http:/www.expasy.org/sprot/); 采用EXPASY服务器提供的SOPMA、GOR、nnPredict、HNN方法 预测LMP2二级结构(http:/www.expasy.ch/tools) ; 采用EXPASY服务器提供的SOSUI方法预测LMP2跨膜区域 (http:/www.expasy
9、.ch/tools) ; 采用EXPASY服务器提供的Hopp 2. pET32a/ozlf-67; 3:pET32a/ozlf-67/EcoR I; 4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I 图5 重组质粒pET32a/ozlf-69酶切鉴定 1:DNA/Hind DNA Marker; 2. pET32a/ozlf-69; 3:pET32a/ozlf-69/EcoR I; 4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I 图6 重组质粒pET32a/ozlf-71酶切鉴定 1:DNA/Hind DNA Marker; 2. pET32a/ozlf-71;
10、 3:pET32a/ozlf-71/EcoR I; 4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I 重组质粒酶切鉴定 琅 篓 豆 疯 喊 镇 雄 冤 决 葬 嫌 息 纹 禾 踞 渝 来 邪 综 挟 嫁 琵 撼 当 扼 囱 绳 审 鞘 肩 揍 孔 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 结 果 测序结果 图7 3个重组的目的基因的测序图 温 俯 懒 掀 莎 拳 吸 钓 斥 炔 馆 韵 复 比 憾 骂 稠 痰 陌 坐 砚 巩 草 宪 啮 哨 妄 铂 铃 拥 济 灯 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩
11、 结 果 B细胞表位融合蛋白鉴定 图8 B细胞表位融合蛋白表达产物 SDS-PAGE和Western-Blot分析 1:蛋白分子标准物; 2:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-67蛋白表达; 3:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-69蛋白表达; 4:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-71蛋白表达; 5:IPTG诱导重组质粒pET32a蛋白表达; 6: BL21 怀 邻 墟 瘁 酬 刊 绊 妥 憨 夹 敲 成 迄 窃 晶 蹲 胡 帅 我 可 吻 硫 认 谊 隋 悯 吏 左 础 瘪 墩 舰 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩
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