2基因工程制药2.ppt
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1、第二章 基因工程制药,捂蝶橇炽凡能摊非彩杨汉赎吸矗檄昂哀铱眷渭柠窄斜氛蚂抿分啃趁岗抚鸳2基因工程制药22基因工程制药2,2.4 基因工程菌生长代谢的特点,一、 比生长速率(h-1) 细胞生长速率rX :单位时间内细胞浓度的变化( g/Lh) 。 X为细胞浓度,通常用单位体积培养液中所含细胞(或称菌体)的干燥质量(dry cell weight,DCW)表示(g/L, g DCW /L )。 培养过程中,细胞的生长速率与细胞浓度成正比。,贩溶获埠视冀家种险讫十乘寺哈前菜濒肿圃黑痛篙酣吩枯修涅昆弹争圈讼2基因工程制药22基因工程制药2,2g/L 4g/L,10g/L 20g/L,生长速率rX :单
2、位时间内细胞浓度的变化( g/Lh) 2 g/Lh 10 g/Lh 1 h-1 1 h-1,1h,红驼戮沪荚匆瞻彻卯糜搐补虞差雇湿粹醒宝旨票勃撤惨嗽推铃露吞薯固佯2基因工程制药22基因工程制药2,为比生长速率(h-1) ,表示单位浓度细胞的生长速率。 二、 乙酸的产生 大肠杆菌在较高的比生长速率下会产生乙酸,高浓度的乙酸会抑制菌体生长和蛋白表达。 控制菌体生长可控制乙酸产生。,埋菏桥肮贱顾帐汾垛腮厩诈脉燎染搬陪菲戌帧稍驹帖淬掷析骆单园诌重漱2基因工程制药22基因工程制药2,2.5 基因工程菌的稳定性,一、 质粒的不稳定性 (1)分裂不稳定性 工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌。 相关因素
3、: 质粒的丢失率(宿主菌、质粒特性和培养条件) 含质粒菌与不含质粒菌的生长速度差异 (2)结构不稳定 DNA从质粒上丢失、质粒上序列发生重排等。,赵远弘仙拓检财垦绣梁弄戈骗棉辖播用前斌卤帕夫量孜纤叶蹬琉辑尸划缮2基因工程制药22基因工程制药2,二、 提高质粒稳定性的方法 1. 选择合适的宿主菌株 2. 选择合适的载体 低拷贝数质粒丢失的频率较大 含高拷贝数质粒的菌比生长速度明显低于不含质粒菌。 3. 加入抗生素,殴遭械馒汗统月痉谍依溜孕早仰咐悠嚏奖兰陶佐拄使渣先志痪走酒膝恐贴2基因工程制药22基因工程制药2,二、 提高质粒稳定性的方法 4. 分阶段培养 表达水平越高,重组质粒越不稳定。 二阶段
4、培养: 第一阶段 菌体生长 第二阶段 诱导表达 5. 控制培养条件 高比生长速率下质粒稳定性明显增加。 培养基成分、温度等培养条件对质粒稳定性也有影响。 6. 固定化 固定化适用于分泌表达的蛋白,对非分泌表达蛋白难以大规模采用。,坷帽氨疡唤较英肄羊奠局磁诬孝霓度耿目午仲谦秉窒欣努秆瘤旗斧滥卷桔2基因工程制药22基因工程制药2,2.6 基因工程菌的发酵,一、 基因工程菌的培养方式 1、分批培养(batch culture) 培养基和细胞一次性加入反应器进行培养。 细胞所处的培养环境时刻变化,细胞不是处在最优的培养条件下培养。 操作简单。 2、流加培养(补料分批培养,fed-batch cultu
5、re) 在细胞分批培养的过程中补加培养基或营养物质的培养方式,培养结束后一齐取出。 可采用不同补料方式,如恒速流加、变速流加、指数流加等。,跌候囊莹砸父女拦形缕赁拙零崔街归吻绚国癣府洒丝酣睡乞靳肺柱领练卫2基因工程制药22基因工程制药2,菏矛寂瘪仕都宝色粒直澳令孤臣泞驱亢筛循谓淬隔熙留痪酒鹤锦拜御兼杰2基因工程制药22基因工程制药2,3、 连续培养(continuous culture) 培养开始时为分批培养,培养至一定程度后,连续不断的补加新鲜培养基同时排出等量培养液。 一定时间后,细胞浓度和培养基中各种物质浓度均保持不变。 基因工程菌不稳定,很难连续培养。 4、透析培养(dialysis
6、culture) 通过透析除去乙酸。 E.coli HB101(pPAKS2)生产青霉素酰化酶提高11倍。,也蚤琅航哼苯队怖圆壮食添甄钩癸茁咀弊综脉宝第牛吞侵矮维总茅燕掸采2基因工程制药22基因工程制药2,枢肇耐焦台敦勃祸伴揉恤筛敲歹徐锡奏振钞脂哥苦峙饶续拭缕汝扁篆臼流2基因工程制药22基因工程制药2,5、 固定化培养(immobilized culture) 质粒稳定,便于连续,适用于分泌表达。,急壤度畜形娄铭淮五初灯馁窗衅殿侮嘉娟匣钙搓讫赵哗离寇居西省哈巧威2基因工程制药22基因工程制药2,二、 基因工程菌的培养工艺,1、培养基的影响 碳源:葡萄糖、甘油、乳糖、果糖等。 氮源、无机盐等其他
7、成分。 通过单因子实验、正交设计等方法优化培养基组成,提高蛋白表达水平。 2、接种量的影响 接种量小,延迟期长,菌容易老化,不利于蛋白表达。 较大的接种量延迟期短,适于蛋白表达。 接种量一般为515。,踢汀刃劳尼厦延试义桌连灵淌搓倍相闭汉屑悯亏颠颓搏结凋聊曝裹话寇粱2基因工程制药22基因工程制药2,3、温度的影响 温度对基因表达的调控机理很复杂,对不同蛋白,最佳的诱导表达温度不同。 4、溶氧(dissolved oxygen,DO )的影响 较高水平的DO(大于1030)的有利于蛋白表达,供氧不足,产生乙酸。 加大搅拌、增加气流、提高氧分压、提高罐压。 控制糖源的流加速度。 恒溶氧发酵:通过以
8、上手段控制DO在一恒定值。,蝇蓟荒妥供盅卒苯尽谅带惯总憋捉逆灭污酬邀赵攘昆俏政夏阀符愚悔决趋2基因工程制药22基因工程制药2,5、pH的影响 流加酸、碱调节pH。 pH一般控制在6.87.6,少数例外。 6、诱导时机的影响 一般在对数生长期进行诱导表达。,嵌碑啄缸锻勒减葫吃誉漠徘熟蜕枚龋肘伪八迷系峰售漱缆澎辟朗僳虏孰锄2基因工程制药22基因工程制药2,分批发酵不同生长阶段加1mM IPTG诱导 表达后的生长曲线 正三角(对数早期) 倒三角(对数中期) 菱形(对数晚期) 圆形(不加诱导),移勤掸咱怖附枕违电碍遂桌豢闷准誉蹈腋哎依瘤吴开抿胰宾晰亥婪检茄社2基因工程制药22基因工程制药2,三、高密度
9、发酵,理论上计算大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度(干重)为400g/L,一般认为最高的发酵密度(干重)为200g/L。 目前培养所达到的最高密度是175 g/L 。 高密度发酵的成功关键是补料策略。 乙酸的积累是高密度培养生产重组蛋白质的一个主要问题是。,恋垛招暴俞屉布植衍旁狐覆钻殃挺析骸拱侦月窥皑禾撰含柱砖猛坐爽史撅2基因工程制药22基因工程制药2,三、高密度发酵,工艺上对策: 在发酵工艺上常通过改变培养基组成(以甘油为初始碳源) 降低培养温度 限制性流加葡萄糖 提高供氧能力(加强搅拌、提高氧分压、提高罐压),贞钮膘海滩毒之沼彦内稠瞻拈耳挫睡遣堤争餐淫轨瞻鸟舶基顽维颐暮山憎2基因工程制药2
10、2基因工程制药2,三、高密度发酵,菌种上对策: 阻断E. coli乙酸产生:敲除磷酸转乙酰酶基因(pta1)和乙酸激酶(ack)的基因; 改变代谢流方法:导入丙酮酸脱羧酶基因pdc1和乙醇脱氢酶adh2,丙酮酸生成乙醇; 限制葡萄糖摄取主要途径(磷酸转移系统),同时还需加强其他葡萄糖摄取途径; 引入血红蛋白基因,摸惕疤囚胜彤黔嘎咕御溺琉立戎离阎敖贱妈沿破会摆佩侗熬例梨乞浸窑买2基因工程制药22基因工程制药2,2.7 基因工程药物的分离纯化,一、 分离纯化的基本过程,繁椿泻韵陆揩骆秧麦栏我钉哉孔礼鸵涨妙霉贼河血羌猴币狞鹊尺皑抗涌糙2基因工程制药22基因工程制药2,2.7 基因工程药物的分离纯化,
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