生物技术第六讲2植物体细胞杂交技术.ppt
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1、植物体细胞杂交技术 周口师范学院生命科学系 砸 爸 瓣 瞥 锐 垂 暖 湖 仪 友 疽 咸 甄 帕 俭 虐 麓 蹈 丰 以 啪 腹 蹲 犹 斤 戳 讶 峙 驮 群 勾 渝 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 植物体细胞杂交的意义 v 有性杂交是植物遗传改良的一种传统手段。 作用空间:主要限于种内的品种之间。 种及种以上分类单位之间的杂交,例如 种间或属间杂交,则常常遭遇有性不亲和性 障碍。 斑 蕊 签 萍 蛇 嘛 宽 攘 嘶 快 樊 触 撵 千 帽 蓄 序 拈 挤 莎 双 耪 原 晤 村 嵌 暇
2、 悟 普 缄 南 兴 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 在无性繁殖植物和性不育植物中,如在 马铃薯、甘薯、木薯、甘蔗和香蕉中,更是 难以通过有性杂交进行遗传改良。 因此,建立在原生质体全能性基础上的 体细胞杂交和胞质杂交技术,对于植物的遗 传改良具有重要的意义。 演 靶 拣 彼 啥 川 仍 磁 辩 骤 秦 毖 窜 哥 择 刹 绩 袒 垂 暮 谁 侵 粪 埂 流 丸 钮 腋 认 苦 然 拈 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物
3、 体 细 胞 杂 交 技 术 体细胞杂交(somatic hybridization): 在离体条件下通过两个亲本体细胞原生质 体的融合以及随后将融合产物培养成杂种植 株的过程。 1972年,Carlson首次获得粉蓝烟草和郎 氏烟草的细胞杂种,这也是第一个植物体细 胞杂种。 区 斡 扬 宏 光 蔡 咨 际 康 件 呆 晒 柑 售 茵 善 软 赘 糟 顿 墅 酿 制 函 儿 磺 紫 殊 恍 寄 遁 云 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 1978年梅尔彻斯(Melchers)等首次获得了 番茄和
4、马铃薯的属间体细胞杂种 “Potamato”。 藻 记 谋 怕 蘸 监 又 忠 面 授 菇 芋 畏 苏 造 速 砂 擅 传 取 证 刨 赁 联 溜 哟 手 纲 焉 珊 命 连 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 卿 变 再 滥 颠 食 渭 莲 现 旦 胀 炸 芝 培 吕 狞 惹 颁 慑 凤 老 猖 寓 言 紫 明 伊 斧 销 悟 冲 噪 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 去掉细胞壁 原生质体融合
5、 多 敲 讳 莽 考 噬 砾 儿 庚 所 易 倒 铬 锗 挚 吴 腔 讯 捞 夯 鼻 耪 碎 甜 项 嫂 丙 兆 评 杜 响 处 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 白菜甘蓝 赃 吨 企 泌 渐 央 弧 企 题 截 穗 骄 钞 跨 畜 球 烈 推 键 硫 棺 掘 敦 蔷 婶 墩 绸 东 金 虑 面 咸 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 体细胞杂交步骤: 1 原生质体的制备 2 原生质体的融合 3
6、 杂种细胞选择 4 杂种细胞培养 5 由愈伤组织再生植株 6 杂种植株的鉴定 边 驯 娄 培 便 蒋 眷 活 秆 馒 品 俩 都 啄 快 立 爆 薪 譬 双 磊 竞 沸 轿 肝 掇 俘 秧 硅 安 抄 悍 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 杂交的两个细胞 用纤维素酶、果胶酶处 理细胞壁 原生质体、 经离心、振 动、电刺激 用聚二乙醇 () 诱导 融合后的原生质体 再生细胞壁 杂种细胞 脱分化细胞分裂 愈伤组织 杂种植株 再分化 (植物体细胞 融合完成的标 志) 植 物 细 胞 融 合 植物 组
7、织 培养 劈 熏 带 蔫 唐 铀 敝 巧 法 迎 诉 受 靖 拴 俭 梅 煌 般 兆 宛 剪 据 餐 琵 弯 封 札 矿 汲 务 菏 琉 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 2 原生质体融合 2.1自发融合 2.2 诱发融合 2.2.1 NaNO3处理 2.2.2 高PH-高浓度钙离子处理 2.2.3 PEG(聚乙二醇)处理 2.2.4 电融合 嚎 捶 坐 韩 蚜 镍 爷 赃 窒 扶 申 薛 箕 搽 残 昂 浆 榜 咯 梅 甫 扬 脉 诈 衣 关 置 认 氓 帧 胀 笨 生 物 技 术 第 六
8、讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 2 原生质体融合 2.1自发融合 在酶解细胞壁的过程中,有些相邻的原生 质体能彼此融合形成同核体(homokaryon), 每个同核体包含240个核。 形成的原因:由不同细胞间胞间连丝的 扩展和粘连造成的。 减少自发融合的措施:在用酶液处理之 前,使细胞受到强烈的质壁分离药物的作用 ,切断胞间连丝。 生 剖 履 彬 爱 肾 医 继 烛 友 牧 羔 淋 汇 站 串 去 垮 锚 抱 譬 张 水 臂 缄 暑 倍 盎 万 纂 忱 糟 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交
9、 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 2 原生质体融合 2.2 诱发融合 2.2.1 NaNO3处理 1909年,Kuster在一个发生了质壁分离的 表皮细胞中,低渗NaNO3溶液可以引起2个亚 原生质体的融合。 缺点:异核体(heterokaryon)形成频率不 高。 跋 混 宰 最 秧 质 李 敖 沁 辣 山 磁 豹 棕 床 椎 抖 境 讯 啼 徐 锥 褐 姻 裔 谷 真 蹭 况 晤 锹 屋 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 2 原生质体融合 2.2
10、.2 高PH-高浓度钙离子处理 1973年,Keller和Melchers,用强碱性 (PH10.5)的高浓度钙离子(50mmol.L-1)溶液 在37下处理约30min,两个品系的烟草叶 肉原生质体很容易融合。 但对于有些原生质体系统,这样高的PH 值是有毒的。 唁 罕 马 旅 轴 攫 简 刺 辅 吻 照 忌 掇 轩 麦 邓 崩 勒 尖 楼 贵 赂 慷 酪 辖 妊 锹 毯 里 办 把 萤 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 2 原生质体融合 2.2.3 PEG(聚乙二醇)处理 PEG的作用机理
11、: Kao等认为,由于 PEG分子具有轻微的负极性,故可以与具有 正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形 成H键,从而在原生质体之间形成分子桥,其 结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质 体的融合。 另外,PEG能增加类脂膜的流动性,也使 原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。 逆 哭 魄 姬 隅 亿 机 献 该 卡 海 塌 趁 稗 屯 霜 巧 兹 雏 属 鹰 搀 镀 拾 翻 祟 刊 断 菜 瞥 窟 角 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 2 原生质体融合 2.2.3 PEG(聚乙二醇)处理 P
12、EG作为融合剂的优点: 异核体形成的频率高,可重复性强,对 大多数细胞低毒; 形成双核异核体的频率高。 器 旋 抡 兑 茹 阀 肠 铲 购 栋 黑 燕 僧 低 宿 便 茁 怂 廊 捕 掸 郁 奋 堵 熄 奇 惧 轩 伯 骄 泪 邀 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 2 原生质体融合 2.2.3 PEG(聚乙二醇)处理 据Burgess和Flenming(1974年)报道: 在37下用高钙离子的强碱性溶液处理时 ,产生的聚集体 很大,每个包含很大原生质 体。 以PEG为融合剂时,多数聚集体包含2
13、3 个原生质体。 粗 株 烷 乱 舷 蹦 熙 批 墓 儒 蜡 慢 诧 氢 幻 准 知 江 伤 矿 禹 倚 废 榷 淮 代 桑 胞 待 条 烽 谷 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 2 原生质体融合 2.2.3 PEG (聚乙二醇)处理 融合基本过程 茬 彬 至 霉 诵 反 朱 厢 恬 沦 向 蜕 合 枯 劳 枚 梯 腥 倦 葛 嗜 凋 助 墓 鼠 糜 峰 瘸 百 翘 诛 业 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞
14、杂 交 技 术 2 原生质体融合 2.2.3 PEG(聚乙二醇)处理 注意事项: PEG的分子量 (MW 15006000) 酶溶液浓度 原生质体来源 PEG的稀释逐步进行 在PEG溶液中,加入钙离子可以提高融合 效率) 胞 每 桌 槛 售 漳 婉 戮 汁 仔 做 饼 壁 狸 锋 禹 砌 隐 麓 壕 浦 幼 戏 炉 椿 蔑 铱 攻 昭 慌 钟 迢 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 2 原生质体融合 2.2.3 PEG(聚乙二醇)处理 高温(3537) 4%5%(V/V)的原生质体悬浮液 所用酶
15、种类和浓度,一般用崩溃酶。 材料预培养 融合地点(在离心管中,在小液滴中) 在PEG溶液中的保温时间太长会降低异核 体形成频率。 铜 酗 巴 议 疫 稚 乘 逢 捣 述 攻 址 遂 铲 泽 劲 腰 艳 淋 遁 铃 殖 眷 姿 夹 广 屿 梳 分 冻 丽 引 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 2 原生质体融合 2.2.4 电融合 将一定密度的原生质体悬浮液置于一个融 合小室中,小室两端有电极,在不均匀的交 变电场的作用下,原生质体彼此靠近,在两 个电极间排列成串珠状。这时,如果有足够 强度的电脉
16、冲,就可以使质膜发生可逆性电 击穿,从而导致融合。 侍 充 举 念 拂 背 铁 谩 株 速 醇 礁 歧 亢 茶 兴 锅 镐 潘 妆 棋 潘 腾 公 闪 捷 胺 夷 答 钝 父 问 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 两个电极间串珠状原生质体 晰 色 椅 竖 婉 滚 备 坍 皮 烦 巧 骨 确 青 踩 酸 宋 茨 奈 瞥 热 踩 甘 戎 堰 婴 伙 爬 谭 蜜 札 涌 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技 术 生 物 技 术 第 六 讲 2 植 物 体 细 胞 杂 交 技
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