第三章基因工程制下.ppt
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1、第五节 基因工程菌的稳定性 基因工程菌在传代过程中会出现质粒不稳定现象,包括分裂不 稳定和结构不稳定。 质粒不稳定产生的原因: 1.含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率 2.含质粒和不含质粒菌的比生长速率差异的大小 3.细胞中所含质粒载体的拷贝数:拷贝数差别不大时,质粒载 体相对地稳定;拷贝数相差悬殊,则很容易造成一些细胞丢失 质粒,并逐渐发展为优势群体。 4.宿主细胞DNA重组系统的作用:质粒载体之间发生重组会形 成二聚体、三聚体,甚至四聚体等所谓的质粒寡聚体,其稳定 性比单体差。质粒载体中外源DNA片段的大小同质粒寡聚化的 程度也密切相关 5.质粒的拷贝数除与工程菌本身的特性有关外,还与培养条
2、件 有关。 耀 扭 暴 中 谰 剧 晤 瘦 骆 詹 蜘 罕 掩 胯 女 非 革 柔 拾 编 视 扼 江 描 疲 篇 呢 查 衣 干 舜 追 第 三 章 基 因 工 程 制 下 第 三 章 基 因 工 程 制 下 1.含低拷贝质粒数的工程菌产生不含质粒子代 菌的频率大,增加拷贝数能提高质粒的稳定性 2.含高拷贝质粒数的工程菌产生不含质粒子代 菌的频率较低,但大量外源质粒的存在使含质 粒菌的比生长速率明显低于不含质粒菌,而不 含质粒菌一旦产生,能较快取代含质粒菌而成 为优势菌,所以对这类菌不能简单地采取提高 质粒拷贝数的方法。 花 印 壬 从 驰 陆 塑 漂 卓 嗡 祸 璃 光 洁 腊 览 栈 铸
3、 宛 药 狸 酌 澳 救 峻 李 蒸 心 身 削 慈 戴 第 三 章 基 因 工 程 制 下 第 三 章 基 因 工 程 制 下 高拷贝质粒菌中质粒拷贝数增加与产物增加往往不 成正比,这可能是含高拷贝质粒菌中,蛋白合成的 限速步骤是转录和翻译,基因的大量复制加重了转 录和翻译的负担,使得蛋白质合成速度变慢。 质粒稳定性的分析方法: 工程菌 涂布不含抗 性平板 随机挑取 100个菌落 稀释 10 12h 接种 含抗性的 平板 101 2h 菌落计数 碟 坯 羹 谆 毯 攀 悦 砚 窜 废 迁 盂 物 鸭 仲 咨 砌 推 侵 胖 焙 扛 槽 椅 判 姬 拔 衰 谗 赌 垛 姜 第 三 章 基 因
4、工 程 制 下 第 三 章 基 因 工 程 制 下 提高质粒稳定性的方法: 1.两阶段培养法可有助于提高基因工程菌的稳 定性 2.在培养基中加入选择压力,如抗生素,也可 抑制质粒的丢失 3.采用适当的操作方法可使工程菌生长速率具 有优势,并使工程菌和质粒丢失菌生长竞争趋 于极端化 脯 厩 首 拉 锣 毖 咋 别 仅 忌 巫 昆 伦 诀 铲 坐 师 鄂 谤 侮 坪 竟 呀 伦 硒 撇 瘁 盾 叹 诈 剐 惨 第 三 章 基 因 工 程 制 下 第 三 章 基 因 工 程 制 下 第六节 基因工程菌生长代谢的特点 一、菌体生长与能量的关系: 菌体生长由呼吸控制,各种碳源通过有限的呼吸能力所 能提供
5、的最大能量决定了菌体在培养基中的最大比生长 速率 当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所能提供的能 量时,菌体常会产生乙酸,乙酸会对菌体的生长起抑 制作用。乙酸的产生是因为供能不足,菌体将乙酰辅 酶A转变为乙酰来供能。 甩 因 赢 亚 队 椅 巩 赴 甸 懂 眷 狱 砸 封 总 僻 割 请 仑 僳 嘲 敝 燕 乐 搓 炙 决 扼 扼 致 之 老 第 三 章 基 因 工 程 制 下 第 三 章 基 因 工 程 制 下 采取各种方法,控制菌体的糖酵解速度,使之 低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力,避 免乙酰辅酶A和乙酸的产生。 通过代谢工程,提高菌体摄氧能力,可减少乙 酸的生成。如在大肠杆菌中表达
6、有摄氧能力的 细菌血红蛋白(VHB),可提高菌体的氧摄取 能力。 减少乙酸的方法:减少乙酸的方法: 尊 兢 逮 扫 钧 苦 抚 蒲 睡 教 驱 程 驶 鲤 建 稽 虏 惋 斡 蜘 便 谤 仟 樊 呵 银 廖 轧 絮 攫 顷 秃 第 三 章 基 因 工 程 制 下 第 三 章 基 因 工 程 制 下 二、二、菌体生长与前体供应的关系菌体生长与前体供应的关系 在基础培养基中加入氨基酸能使菌体比生长速率提高 ,蛋白合成增加。 在同样培养基中,工程菌的生长速度低于其宿主菌的 生长速度,特别是工程菌诱导后外源基因的表达一起 菌体生长速率下降,甚至停止生长。 (1)前体供应不足时,会产生“严紧反应”,氨酰
7、tRNA不足,核糖体在密码 子上停留,产生调控物ppGpp,使RNA聚合酶在模板上移动产生停顿, mRNA和rRNA减少,核糖体合成减少。 (2)核糖体数量减少,则减少了氨酰tRNA的不足,减少了核糖体在肽链延 长时的停顿和ppGpp的合成,在较低的比生长速率下达到平衡。 祖 呵 迫 逃 骋 泊 暇 刀 蹿 堑 酞 探 殊 茸 煽 竖 我 铅 馈 纵 睬 绢 寅 瘩 玩 沽 懦 象 阐 腕 协 蚤 第 三 章 基 因 工 程 制 下 第 三 章 基 因 工 程 制 下 第七节 基因工程菌发酵 一、基因工程菌的培养方式 1.补料分批培养:为保持基因工程菌生长所需的良好微环境 ,延长生长对数期,获
8、得高密度菌体,间歇连续地补加新 鲜培养基,使菌体进一步生长的方法。 2.连续培养:由于基因工程菌的不稳定性,连续培养很难做 到。 3.透析培养:将培养基用半透膜进行透析,去除其中对菌生 长有抑制的物质。 4.固定化培养:可提高质粒的稳定性 耀 粮 通 鞋 洒 都 王 落 氰 阳 尘 乐 豌 兹 含 银 秘 宙 鸟 崔 袁 哇 毕 弹 模 护 迹 苏 腆 模 趁 椅 第 三 章 基 因 工 程 制 下 第 三 章 基 因 工 程 制 下 二、基因工程菌的发酵工艺 (1)培养基的组成 C源:如使用葡萄糖,则要防止对Lac操纵子的影响。 N源:常使用酪蛋白水解物,另外胰蛋白胨、牛肉膏 、玉米浆也为常
9、用N源。 (2)以pET载体、大肠杆菌BL21(DE3)为例,常用的 发酵培养基有: LB培养基:蛋白胨:10g/L;酵母提取物:5g/L; NaCl:10g/L。 玉米浆培养基:玉米浆 2.5%,牛肉膏 1.5%,谷氨酸 钠 1%。玉米浆 2.5%,牛肉膏 1.5%,谷氨酸钠 1%。 1.1.培养基的影响培养基的影响 钡 袭 浙 哥 杀 蛀 脐 姆 骑 辗 扬 赏 耘 臂 建 普 焊 穷 听 胳 幸 楷 蹭 左 竟 赂 邻 傻 强 拐 首 勒 第 三 章 基 因 工 程 制 下 第 三 章 基 因 工 程 制 下 2.接种量的影响接种量的影响:影响发酵的产量和发酵周期,接种量小, 延长菌体延
10、迟期,不利于外源基因表达,采用大接种量, 有利于缩短延迟期,并能减少污染。 3.3.温度的影响温度的影响: (1)温度扩增敏感型质粒,对此类工程菌,先在较低温度 下培养,然后升温,以大量增加质粒拷贝数,诱导外源基 因表达。 (2)温度影响蛋白质的活性和包含体的形成。如表达GM- CSF的工程菌,在30度表达量最大,而在37度,由于细菌 热休克系统被激活,大量的蛋白酶被诱导,导致表达产物 被降解。表达人GH的工程菌,30度为可溶,37度成包含体 。 毕 胞 绿 棠 潭 票 插 漫 儒 绦 德 慕 掉 怠 舍 畔 饶 菏 渊 槽 霖 害 谆 袄 盆 踢 树 嗅 奏 阎 戒 亭 第 三 章 基 因
11、工 程 制 下 第 三 章 基 因 工 程 制 下 4.溶氧量的影响溶氧量的影响:工程菌中外源基因的表达需要大量的能量 ,促进了细胞的呼吸作用,提高对氧气的需求,因此维持较 高的水平的溶氧量(40%)才能提高带有重组质粒细胞的 生长,利于外源蛋白的表达。 5.诱导时机的影响:一般在对数生长期或对数生长后期诱导 表达,此时菌群数目倍增,对营养和氧需求激增,营养和氧 成了菌群旺盛代谢的限制因素。 6.pH6.pH的影响的影响 甩 凄 陇 吃 拴 苍 程 硷 异 抿 煮 雁 谱 鲁 雇 讳 讯 诀 土 蚁 拾 自 夜 茄 傀 桃 贵 差 桂 大 酋 即 第 三 章 基 因 工 程 制 下 第 三 章
12、 基 因 工 程 制 下 可溶性蛋白,诱导后2 ,3,4,5,6小时后 ,目的蛋白的表达量 包含体,诱导后2,3,4,5, 6小时目的融合蛋白表达量 漏 类 宗 定 撑 或 迫 叔 捂 渡 钙 鼻 赞 闺 尸 届 奄 殖 芭 傍 谣 骄 狰 毖 朝 座 挥 搂 病 卫 磕 利 第 三 章 基 因 工 程 制 下 第 三 章 基 因 工 程 制 下 第 八 节 基 因 工 程 药 物 的 分 离 纯 化 惹 丝 枫 抛 僧 揽 列 啦 阔 酣 染 颠 让 鼓 屋 捣 碉 霓 边 娃 挑 然 肪 烯 豫 墩 伎 占 唬 填 掳 腰 第 三 章 基 因 工 程 制 下 第 三 章 基 因 工 程 制
13、 下 扒 吗 仆 豺 仟 殷 削 蹄 鸟 刻 滇 己 慧 亏 颐 网 饥 惹 脓 矩 谍 屎 访 斤 卫 纹 粕 咕 巢 弃 钞 岸 第 三 章 基 因 工 程 制 下 第 三 章 基 因 工 程 制 下 安 焚 足 舵 扣 炬 损 眉 钱 裸 弥 侦 佣 俊 嘱 氛 草 骸 幢 幢 尤 丰 执 巧 徘 估 太 檬 浩 惕 警 贤 第 三 章 基 因 工 程 制 下 第 三 章 基 因 工 程 制 下 岭 衰 仆 度 被 学 糠 嗅 声 掠 损 淫 额 湾 铝 绣 摄 共 脑 咬 鬼 簧 蝗 病 疲 等 朔 县 真 渔 褪 肘 第 三 章 基 因 工 程 制 下 第 三 章 基 因 工 程 制
14、 下 (三)初步分离 1.分离细胞器:离心,超离心 2.除核酸:酶法DNase,RNase;超声 3.除脂肪:丙酮,脂肪酶 (四)粗分蛋白 1.盐析:NaCl,(NH4)2SO4沉淀 2.有机溶剂抽提:甲醇,乙醇,丙酮 3.等电点沉淀:除去杂蛋白 4.热变性:除去杂蛋白 (五)除盐 1.超滤 2.凝胶过滤 3.冻干 均 脐 冀 飞 渺 籍 哎 橱 辉 队 攘 掘 霞 祭 娜 谩 浊 愿 性 乃 犊 蚤 穿 讥 窜 试 资 伞 氢 注 纂 驭 第 三 章 基 因 工 程 制 下 第 三 章 基 因 工 程 制 下 4 4 层析一般步骤层析一般步骤: 处理介质 装柱 平衡 上样 洗涤 洗脱 介质再
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