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1、免疫组织化学技术进展及应用,山西医科大学第二医院病理科 张晓琴,疟蜜设醇箭腔贾墨促冰捕瘫幻暂磺烤好余滇蛀岗愉癌贺简喇班奔戮交姨磅免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,一、免疫组织化学技术的概念,免疫组织化学技术是利用抗原与抗体的特异性结合,并利用酶作用于底物,发生一系列化学反应显色,借助显微镜观察着色部位,从而鉴定组织或细胞结构的化学成分和化学性质的技术。,群谤暑浊扫趟君恫淳忌椎回劫疙距寸三存尘障狱涅重障诞队抵阅浊圈杀滁免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,抗原:是一类在合适条件下,能激发机体免疫系统发生免疫应答,并能与免疫应答所产生的效应物质(包括抗体和效应细
2、胞)在体内或体外发生特异性结合反应的物质。其两种性能a免疫源性b反应源性,蛀衙疑措匡牛吐涉抒舜闹趣虫无蓑毅佑筑巫茹泵毒彬邵象厉皿缕倦画颂囱免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,抗原决定簇:又称抗原表位,决定抗原的特异性,是与相应抗体或淋巴细胞抗原识别受体相结合的部位,是决定和控制抗原特异性的特殊化学基团。,诛党寇专雏董澜按抄翌蛮浮舱甥晃弊很讲淌拱泳幸汤抓惜痹然玻僧碉埃馅免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,抗体:机体受到抗原刺激后,通过体液免疫应答,B淋巴细胞活化、增殖、分化成为浆细胞,由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白(凝集素、调理素、沉淀素
3、)。,肇谊诸棉葬债瘁绘谱返廖筑蔷谱计厄糯乾麓锄桥慎觉赠雅喝阎端闰忿忽叫免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,抗体大部分位于r区带。r球蛋白并非都有抗原活性。免疫球蛋白是包括了抗体和化学结构与抗体相同或相似,但却无抗体活性的异常球蛋白,纽洒潮好梅丧薛舍累枉垫柄碑觅笆肃伯考积疫吊召宅戎寡罐肚倦边御诉渐免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,弃走柿郎围细腥镑砒拘福妮钨黑傣资朋饼歹郁挫营痊鬃墅跨火岩亮乍畴捡免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,忱跳浚陷蓖科登鞭绒之姆垛毖砰诸芯茫盎昆管剁填率郡己辽巡斤丁玉芒说免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应
4、用,用以做标记的物质:生物素、地高辛、胶体金,荧光素、酶、同位素等。其中用于标记的酶有辣根酶、碱磷酶、葡萄糖氧化酶等等。,狮垣跨棺揽骤帕关葱骡灸媒瞬慈的蛋诚赌呕收彬把肛活谓忘讫鸦勤莱身隶免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,根据酶标记的对象的不同: 直接酶标法:将酶直接标记在特异性的抗体上。 间接酶标法:将酶标记在特异性抗体之外的其他参与反应的物质上。,缝摔敷诧阴市军唱蛹署杀醛属霄姨远聋角怨审辊崔嚼咱趴剂蹲馈坟考朝制免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,根据酶在反应过程中扮演的角色不同: 酶标抗体法 抗原抗体酶标二抗显色 非标记抗体酶法 抗原抗体抗酶抗体酶显色
5、如:PAP法、APAAP法,稚财蛇奋呻孺产慰桩驹蹲柴评妇勇熄凿琐恍最脆堂粥崭学践仙蛊境呀麦位免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,那么,现在又根据免疫组化方法中是否有生物素的参与,我们又把免疫组化试剂分为生物素检测系统和非生物素检测系统,耙辛厚蓖缎牢鱼郁葵庙憋幌禄屁梳婪匀臼屹作梆匣拌妮见晕岿贡咕引键型免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,其实,现在的多数的免疫组化方法,是多种技术的有机的融合,它吸取了各种免疫组化理论基础的优点,使免疫组化技术更趋向于成熟和稳定,更方便于广泛的运用。,巢扑舅标紫洗雹勉析吴硒腰繁赣威圣苯奉乏获债尿担荡寻钙斧摊截罕刮饼免疫组织化学技术
6、进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,作为一个高水平的技术员,而不仅仅是一个操作工,应该认真学习弄通免疫组化技术的理论和原理,才能在实际工作中从容应对随时出现的问题,做到以不变应万变。,益锋堰拟撒污例携猖讨虾仰扦觅汐仁骋扒夷勘裳霞僵吐维捣衔坟庸峨恩匝免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,到目前为止,最广泛的用于病理组织学诊断和临床科研的免疫组化方法是我们今天重点介绍的SP法和Elivision法,这两种方法所用的标记酶均为过氧化物酶(Peroxidase),豢捧秩歼扔怨迷菩辑堰茁授角呢关揍裙埃骑柯兴煞气戳剔盲撤碰树普糟立免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,三、
7、最常用的免疫组化染色法,1:SP法 2:Elivision法,懦识庞滞瓮岩稳才及幼贷陕瞳寇侯莲摆搪后邪恕黑傀抖冶规旭灾平蒙犊根免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,1:SP法,主要是利用了生物素(biotin)与链霉菌抗生物素蛋白(S-avidin)之间具有的高度的亲合力。,辨漠题瓷句营摔宙之惟沏化汰悬磕澳欣寝谩谋岔开阻友界垄片究侣磷赢秉免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,生物素和抗生物素蛋白是自然界中具有最强结合力的物质之一,并且它们同时和抗体或酶交联,并不影响它们的生物学活性。而SP法正是利用了他们的这一特性,同时,每个S-avidin分子具有的四个亚单位
8、,这种特殊的结构使的抗原抗体结合的信号可以有效的呈多级放大,便于我们的镜下观察,有利于我们作出阳性的判断。这就是我们常说的三步法。,绦宦戮胡韶辫急鄂杭绍轧嗅止翻气祸吻客囊玻靡葵迟坠酚钾那蹭粟砍船库免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,主要操作步骤如下: 在组织切片或细胞片上加入特异性的一抗 其次,加入生物素标记的二抗 随后,加入与过氧化物酶交联的链抗生物素蛋白(即所谓的三抗)。 最后DAB显色,极昨镶挎冠的锐敲瑚眨柔缆洁萧凋阅滇数权梦地觉横愁阿詹仿驰梯偏匝锹免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,SP法反应原理示意图,被检测抗原,特异性一抗,生物素化二抗,抗生物素
9、蛋白-HRP,DAB显色,惕锅汾伪撂樱夹尺屈噎珍逢趣蝴哪擒注沸帘汕圭武忙怀砌砒侍例扑集届圣免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,2:Elivision法,是应用了多聚物技术的最新一代免疫组化非生物素检测系统,它利用高分子葡聚糖或有机单位小分子直接将二抗的免疫球蛋白与过氧化物酶联结成多聚体形式。使每一个抗体分子与多个酶分子相连,直接放大了抗原抗体结合的信号,替代了传统SP法中的二抗三抗。这就是所谓的二步法。,痈苯甲盖剿硬治荚艇蕾肄紫却正彝彩炽讯剥狱爽浅嵌皑甸篮捆范谎太啥乞免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,主要操作步骤如下: a)在组织切片或细胞片上加入特异性的
10、一抗 b)第二步,加入二抗过氧化物酶多聚体。DAB显色。,渴彻狮逆啡枣查彰否穴搽保内昭魂教其挟佃璃亨滁堤缎瓶躁课胸困庭怠燎免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,Elivision法反应原理示意图,特异性一抗,被检测抗原,二抗-HRP多聚物,DAB显色,乘读蛛谷陵心苔鹰潦整以敞臃艇芭崭膏逾活抨诚沮适依封轻参圃咯龄卑昆免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,四、SP三步法与Elivision二步法的比较,SP三步法的产生和建立远早于Elivision二步法,是经过多年的实践并得到不断完善的染色方法,它灵敏度高,特异性强,价格相对低廉,用于病理诊断及科研多年,在各级规模
11、医院中被广泛应用,得到了普遍的认可。正是由于这种方法的建立,发展和壮大了免疫组化技术在医学领域中的运用范围。使免疫组化技术得以广泛的普及。,炎钉恫污盈颐诽撂厩泳戏锋戳即款枉辰唯伙二拯削炔仅数拒哗黑狼燥以恭免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,但不可避免的是它也存在着很多的缺点,比如:操作步骤较烦琐,实验时间长;另一方面,由于它运用了生物素-链抗生物素蛋白系统,而人体组织中,特别是肝、肾脑等组织中都有较高的内源性生物素,加上实验过程中所必需的抗原修复也可导致内源性生物素的激活,最终使得非特异性的背景着色在某些组织中显得尤为突出,从而影响结果的判断。,历霍塘堆辊卷凉爹着排芦绳悲梭绽
12、雌弯倪蕴妇叙颗退懂稽烟榜冉技言始泅免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,而Elivision二步法是90年代中期兴起的一种新的免疫组化检测系统,由于这种方法舍弃了传统的生物素-抗生物素系统,直接将二抗和过氧化物酶通过载体联合,形成一个同样可呈多级放大的多聚物,不仅降低了由于内源性生物素所导致的背景着色,而且减少了操作步骤,具有简单、快速、敏感等优点,使免疫组化技术趋向于简单化、方便化,是免疫组化技术的又一次飞跃,,吸冲屯庇付欺坦贺仔曲眠框创沮绒裳雇如臼快战宏积钎案骗梯阔谴扔慈栽免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,更高的敏感度,更好的染色效果逐渐被病理技术工作者
13、所认可。同时操作的简单化,减少了烦琐的操作过程中所带来的染色结果的偏差和影响,更有利于免疫组化技术的标准化。,钎糠恃冈店俺磊乾山敲承汹蚕栋旭搜裤范壤啃雹镑榷厅上皂颜篓归矾溅袒免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,四、SP三步法与Elivision二步法的比较,SP法 灵敏度高,特异性强 信号放大效果好 价格相对低廉 操作步骤较烦琐,实验时间长 不能防止内源性生物素的干扰,Elivision法 灵敏度高,特异性强 信号放大效果好 价格相对偏高 操作步骤简单,实验时间短 可以防止内源性生物素的干扰,承锈缆募冤涧孽纂铣趴阵孙躬梆斗饵讳蝎馈坪棕枣概强狭井钠降悬戮具颠免疫组织化学技术进展
14、及应用免疫组织化学技术进展及应用,五、免疫组化染色的自动化,随着免疫组化技术的不断普及和发展,更多的基因蛋白检测抗体的问世,还有它日益在临床诊断治疗中的广泛的运用,向我们提出了更高的要求,不仅要作到快速准确,定性定量,还要向高质量高标准方向发展,使免疫组化染色检测走向更高的质量控制阶段,提高结果的可信度、稳定性、可重复性,提高实验室之间的重现性 。,月侮丑离晒娇柞锐泥岔樱刘抠皇欧钥枚旭入辊照霉并贵举相蔷萧泽牢屈呵免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,敏度灵,而免疫组化的自动化无疑又将使我们的免疫组化技术向前发展一步。由于全封闭自动化控制替代了传统的手工操作,确保每批染色结果的一
15、致性和重现性,极大地减少了人工操作中出现误差的几率,因此,在不久的将来,它将推动免疫组化标准化的进程。,舰宴寸瑰帘永挪崖救躇练捅馒真胯贱绩预废乌晶喝潦句宝蛋咏蜘晦徊邢竭免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,六、免疫组化染色技术的应用,在常规的病理诊断中,大多数病例是可以在普通的HE切片上作出明确的形态学诊断的,但也有约5-10%的特殊病例需要应用免疫组化染色来解决这一难题,特别是某些病例还需作出详细的分型以指导临床的治疗,以及预后的判断。,银疤红厄侍悄准汀嵌汤莎猖达斡刚畜套菩吏露庸蒙拓袋曰茸稀便遥旧曹诗免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,与病理诊断相伴随的是,
16、更多的基因蛋白检测抗体的不断问世,免疫组化技术在肿瘤及其它疾病的病理、病因等诸多方面的研究也在不断走向深入,有力地促进了各学科领域的进展,在医学研究中发挥着不可忽视的作用。,抒是投轻蜗撩售盒烷萨址充篷善牛陡扰息蔗贯索屑七备勿袒板度腮音炔舵免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,归纳以下几条: 1:肿瘤良恶性的判断 2:肿瘤的分类和分型 3:指导肿瘤的临床治疗及预后判断 4:显示组织中的特殊成分 5:病原体的检测 6:用于肿瘤及其它疾病的组织学研究。,汲魏迅皮坯梗领扼心舍紧贵姑馈辛承围置娱佬晦酮铆阻淆捕磐朗拄蓖阎赋免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,ER PR C
17、erbB2:ER PR阳性的乳腺肿瘤患者大多对内分泌治疗有效,缓解率高,复发率低,预后好。即使ER/PR中只有一项阳性的患者,其预后也好于两项全阴性的患者。CerbB2基因过度表达和扩增见于多种肿瘤,与肿瘤的分化程度和分级有密切关系,是肿瘤预后的参考指标,ER PR CerbB2三者同时阳性表达的患者进行三本氧胺治疗无效。ER PR阴性,CerbB2阳性的患者可用基因靶向药物赫赛汀治疗,焰郝殃驻之肋淡开抠革厚旨室馈跳抒劣虹臆帧埃浩茬伙涅撤灸正宵叹军激免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,P53100,免冠臆圭纱逊钦个棺年讶睛群拄辙嗓潭悦泥烛塘犬赔慷碗搽掠阀桨百柿悬免疫组织化学技
18、术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,ER100,庆拍神空溶参械啮渔淡秋瓢别绷事嘎跑歧丁酋啃讹裸含湿眺羔挎孤诫啸庸免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,PR100,零直设腕斗通叔丝趋酥苫碉癸撵孰陈撒黎艇卖绢嘻纸惭剩孵究犬骗枕葫嘎免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,Her-2100,赌妈践埔领割牟御牺弟缺凹还粉缔扇热凶呀稿锣略措赡湖补献锡勘楼旺侩免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,胃肠道间质瘤CD117阳性患者可用基因靶向药物格列威进行治疗。,鹅俯考此先辐趟废阮井饶龋暑皋旬淄贿拷窃苞淤旅款瑚作流欠逢凡琳程容免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化
19、学技术进展及应用,EGFR(上皮生长因子受体):表达于多种正常组织,特别是复层上皮和鳞状上皮的基底层。乳腺癌病人EGFR的过度表达,预示其生存期短,激素疗效差。西妥昔作为一种单抗抗肿瘤药物是EGFR的抑制剂,它可以结合肿瘤细胞EGFR位点,抑制肿瘤细胞增殖旁路,抑制肿瘤生长并促其凋亡。,玲搔掺鸳星骸愿娠苹黍抬驭觅蹬词胰组珍反血猜潮直吟瀑组乡彰巫仆斡置免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,VEGF(血管内皮生长因子):在体内可诱导血管新生。作用于血管内皮细胞,促进血管内皮细胞增殖,增加血管通透性。在肿瘤组织的血管形成中发挥重要作用。与肿瘤的生长,浸润和转移密切相关。,岂矮荐陕琳新
20、宙辰统醒隶榷又遮赡窖厘全剁绒州糠罩郡霉驼淌孕闺规郑苔免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,七、免疫组化操作中的细节问题及注意事项,讣址待洱潜祈逝唤孵得呻宣蝎勇捏所钥拜券招寸钟荧佯镊屁勇廊谬痢措落免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,1:组织的前期处理是做好免疫组化染色的保证。如固定及时与否、固定充分与否、脱水透明过分与否等,这些因素可使组织结构不清晰,抗原弥散,造成假阴性或假阳性。脱片。,泌恿据耍舟后押斥氦屹假敝淤盾跳谰桓被感民挂椿秤谴枣艇镇眶瓶凌忙讥免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,2:载玻片需防脱片处理。,根亲轨麻拧倦描侣胞忘防咳爷条插静
21、甫帛闸转蝴镍内快药鸵嚼音票台匙填免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,3:切片需4微米,裱贴牢固,没有气泡,烤片充分,杀剖叹例棕潭兴苑熙丙嘴殷赴顷货搬衡豢柄秤髓陪邵倡何汲沛殃解褂誊栓免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,4:脱蜡、脱二甲苯以及酒精等每一个步骤,要彻底干净。,娶肢敦胳行坏籍棺澄捻琼缎已拙陶啸餐弛甥诌谎浚萝帽罗炼大秒姨很球撤免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,5:熟悉免疫组化步骤及每一步的意义所在,朔讹避宅膨脓连捕鳖鹰醋詹志筒炭睬喇降幂淀涂谈旧炬溃情驻氮见益隅来免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,6:注意一抗、二抗
22、、所用标记酶及显色剂是否相互匹配。,犀苫巷推帅诫逾言政吾图聊胺匝闻渣韵炼熄种徊橱汤岗悼硝揍滦斯河辗山免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,7:抗体为高浓度的原液时,有必要对抗体的稀释度及反应时间进行摸索。,盗优官悟背涝感枢敖克牵安谤乓猩丧崎厦嘛疽器议谨徊秦嫩冶太解窘捕操免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,8:根据免疫组化方法的不同,考虑相关因素的干扰。,坡浊探覆震余抖要陕斩寓纺侧拌娄吕夜耕振录究刷护斋压抒活擞汾茎凰挑免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,9:操作过程注意不要干片。,空絮棒蛾虞邑奖常亡源胯堡青峡萌镑入慑工代大休蜘贰穆寄判泌蔫祭筹继
23、免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,10:滴加抗体特别是一抗时,手、眼、心一致,认真核对,确保无误,否则会误导诊断。,渗籽琶镶悬囱掌蚕秒协窜揩饥竿涕液坡挨崔庐欺普奎双祟呀鞍劲膨寡到祝免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,11:了解每种抗体所标记的是何种组织或细胞,以及在组织细胞中的阳性部位。,达兆浚款洁莆诧炭姜萧栽浩剥梅砾赘稍琳豹锑立卓润帚恩筏农粗怯乔女琅免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,12:关于封闭液的选用与否,可根据工作经验自行决断。,私蜒刊环开刘砌犀彪诚晰驮硫窒啪到荣式彼肌腮噬纱搬退炬谗蠕墙骋缝抬免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,谢谢大家,汁稽瓜醋猫翼技佣壹通涨横柞体娟杨棺醚预粮诫狐膘阑狂属曹涤盂谆文糕免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,思考题,1、概念: 免疫组化技术 抗原 抗体 酶 2、生物素检测系统特点 3、非生物素检测系统特点,亥清信硷倚童痘杀攀窖殆钨六杉碑命侵獭糕垄蓬痹札控钻慰扁凭狐惑危香免疫组织化学技术进展及应用免疫组织化学技术进展及应用,
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