流式细胞仪常用的几种检测方法.doc
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1、.流式细胞仪常用的几种检测方法(转载)一、测定用乙醇固定的DNA的含量1、培养细胞的DNA含量的测定制备单细胞悬液于200l的PBS缓冲液中;加入2ml预冷的70%乙醇,4保存;附:细胞固定的一般步骤1) 取单细胞悬液12106个细胞于PBS(PH=7.2)缓冲液中;2) 300g离心5分钟,弃上清,反复两次;3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中;4) 将细胞悬液放置于23ml冷70%乙醇中,混匀,保存于4,至少30分钟。在4条件下可保存23周。注意: 根据实验的要求,固定剂也可选用13%多聚甲醛; 将乙醇作为固定剂时,乙醇应预冷至04; 细胞在固定时,固定剂应缓慢滴入细胞悬液中,使固定
2、剂的浓度缓慢增加,并不断震摇,以免细胞成团(特别是用乙醇固定时)。 300g离心5分钟,去上清,再重悬于400l PBS中; 显微镜下观察,若有明显的黏附,须再用筛网过滤; 加入PI(含Rnase),避光孵育30分钟; 上机检测。2、新鲜组织的DNA含量的测定1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液;2) 500g离心5分钟;3) 弃上清,重悬于10ml染色-去污剂中;4) 再过滤,用200目的筛网或7080m的筛网过滤;5) 上机检测。3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定1) 从石蜡包埋切取切片50 m厚,23片,制成单细胞悬液;2) 用PBS缓冲液洗涤,500g离心5分钟,弃上清
3、;3) 加入PI液1ml室温避光30分钟;4) 调整细胞浓度为1106/ml;5) 上机检测。二、细胞凋亡检测及相关分子检测1、细胞DNA含量分布(由细胞DNA降解方式检测细胞凋亡) 收集已固定的单细胞悬液约51051106/ml; 离心除去固定液,3ml PBS重悬细胞; 1500rpm离心,5分钟 ,弃去PBS; 加PI染液1ml,室温避光20分钟; 调整细胞浓度5105/ml; 上机检测。精品.2、磷脂酰丝氨酸外翻分析检测细胞凋亡1) 常规制备单细胞悬液,用PBS洗两次.(若为全血要先溶 血),取约5106个细胞,1500rpm离心,弃上清,用400l 1Binding Buffer重悬
4、; 2) 分成a、b、c、d、e五管,每管约1106个细胞a) 阴性对照,不加任何试剂;b) 阳性对照,加2%多聚甲醛固定30分钟,加AnnexinV 5l,室温10min,用1Binding Buffer洗一次,弃上清再加190l 缓冲液、10l PI避光15分钟 c) 加10l PI,避光孵育15分钟;d) 加5l AnnexinV液,室温避光孵育15min;e) 加10l PI和5l AnnexinV液,室温避光孵育5min;3) 每管各加400l 1Binding Buffer。4) 上机检测。注意 a. 操作动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞;b. 操作时注意避光;c. 反应完毕后尽快检
5、测,最好在一小时内检测。3、用单克隆抗体APO2.7检测细胞凋亡1) 放置0.51106个细胞到试管中;2) 室温离心200g,6min;3) 弃上清,加入100l冷的(4)在PBSF溶液中含100g/ml的digitonnin,轻轻地重悬细胞,在冰上孵育20min;4) 加入2ml冷的(4)PBSF液,室温离心200g,6min;5) 弃上清,加入20l PE标记的Apo2.7 单克隆抗体和80l PBSF液,用vortex轻轻震荡,室温避光孵育15分钟;6) 加入2ml PBSF液,室温离心200g,6min;7) 弃上清,加入1ml PBSF液重悬细胞;8) 避光保存,直到流式细胞仪检测
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