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1、第 1 页 细胞研究论文 特征码 avnKukYNxmBONyPtrkmK 骨缺损(尤其是大型骨缺损)的治疗,由局部伤情复杂和缺乏 理想的修复材料,一直是困扰临床医生和基础医学工作者的一 大难题,而寻找一种尽可能达到或接近自体骨移植效果的理想 的骨替代材料更是无数学者热切探索、孜孜以求的目标。近年 来日趋活跃的骨组织工程(bone tissue engineering)技术为这 一课题的研究带来了新的亮点和希望。目前动物实验已能从骨 膜、骨髓等定向性骨祖细胞(determined osteogenic precursor cells, DOPC)密集处分离培养出成骨细胞,经体外 扩增并与载体结
2、合,回植体内骨缺损处取得骨缺损修复的成功 1 。与此同时,基于对患者易接受性、可操作性和更简单易 行性等方面的考虑,研究者又开始把目光投向诱导性骨祖细胞 (inducible osteogenic precursor cells, IOPC)。其中,在 体内分布广泛、数量巨大、部位表浅、取材方便、培养传代易 行、分裂增殖迅速的成纤维细胞首先成为了研究的焦点。由于 目前许多相关研究尚处于实验阶段,为此,本文着重就成纤维 细胞的生物学特性及其成骨作用等作一综述。 第 2 页 1 成纤维细胞的及其生物学特性 成纤维细胞(fibroblast)是结缔组织中最常见的细胞,由 胚胎时期的间充质细胞(mes
3、enchymal cell)分化而来。在结缔 组织中,成纤维细胞还以其成熟状态纤维细胞(fibrocyte)的 形式存在,二者在一定条件下可以互相转变。 不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常,疏 松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中 所含成纤维细胞的数量要少,故分离培养成纤维细胞多以真皮 等致密结缔组织为取材部位2,3 。 成纤维细胞形态多样,常见的有梭形、大多角形和扁平星 形等,其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不 同而发生改变。成纤维细胞胞体较大,胞质弱嗜碱性,胞核较 大呈椭圆形,染色质疏松着色浅,核仁明显。电镜下,其胞质 可见丰富的粗面内质网、游离
4、核糖体和发达的高尔基复合体, 第 3 页 表明它具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞尚可合成和 分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质。它合成的前 胶原蛋白分子经内切酶作用,聚合和重排,可形成与成骨细胞 合成分泌的胶原原纤维一样具有 64nm(640?)周期横纹的胶原原 纤维,胶原原纤维经互相粘合形成胶原纤维。经检测,这两种 细胞合成分泌的胶原纤维均是型胶原纤维,在形态和生化结 构上完全相同4,5 。 处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞,胞体变小,呈长 梭形,粗面内质网和高尔基复合体均不发达,被称为纤维细胞。 在外伤等因素刺激下,部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤 维细胞,其功能活动也得
5、以恢复,参与组织损伤后的修复。另 外,在结缔组织中,仍保留着少量具有分化潜能的间充质细胞, 它们在创伤修复等情况下可增殖分化为成纤维细胞。 2 成纤维细胞在一般创伤修复中的表现 各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损, 必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此 第 4 页 修复过程中,成纤维细胞起着十分重要的作用。以伤口愈合过 程为例,成纤维细胞通过有丝分裂大量增殖,并从 45 天或 6 天开始合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分,与新生毛细血 管等共同形成肉芽组织,填补伤口组织缺损,为表皮细胞的覆 盖创造条件。在伤口愈合中,成纤维细胞主要于真皮乳头层的 局部成纤维细胞
6、和未分化的间充质细胞,以及血管周围的成纤 维细胞和周细胞。内脏损伤时,参与修复过程的成纤维细胞多 来自间质和包膜,以及粘膜下或浆膜下层的结缔组织。有人认 为创伤愈合过程中伤处聚集的大量成纤维细胞,一方面是由成 纤维细胞通过分裂增殖而来,另一方面,更多地是由邻近的间 充质细胞、纤维细胞和毛细血管周细胞等演变或游走到伤处。 在创伤修复的后期,成纤维细胞通过分泌胶原酶参与修复后组 织的改建。在某些病理条件下,以成纤维细胞为主要细胞成分 的肉芽组织或增生组织块还可以在非骨组织内发生钙化,引起 异位骨化(ectopic ossification)。但对于异位骨化的参与细 胞及其机制尚不十分清楚,未分化间
7、充质细胞、成纤维细胞、 内皮细胞和毛细血管周细胞等可划归为诱导性骨祖细胞的细胞 都有可能参与这一过程6,8 。 3 成纤维细胞在骨创伤修复过程中的表现 第 5 页 最简单和常见的骨创伤即是骨折,其愈合过程须经过炎性 反应、清扫、纤维骨痂和骨性骨痂 4 个阶段4 。不同阶段参 与的细胞主体不同。成纤维细胞从骨折第 3 天起就出现于骨折 局部血肿中6 ,骨折后 5 天即在机化血肿及骨折断端的间隙 及其周围大量存在,是参与纤维骨痂阶段的主要细胞成分 4,5 。在此阶段成纤维细胞一方面大量分裂增殖,一方面又 合成和分泌大量型胶原,使肉芽组织逐步变成疏松的结缔组 织,将骨断端包围起来,形成接合两骨折断端
8、的巨大的纤维骨 痂。然而,这种由无数成纤维细胞和丰富的肉芽组织为主体构 成的纤维结缔组织却不会演变为在其它组织创伤修复时常见的 瘢痕组织,而是通过钙盐结晶在其内部不断沉积,逐渐演变为 骨性骨痂,使骨折局部的修复达到骨性愈合,恢复骨组织的结 构。此时,骨折愈合部只有骨组织而不再存在成纤维细胞 4,5,911 。 4 成纤维细胞的成骨作用 成纤维细胞在骨折愈合过程中不同于其它组织创伤修复的 表现,以及在某些病理条件下可以参与异位骨化6,7 ,使人 第 6 页 们对成纤维细胞的分化能力、钙化骨化能力以及在成骨过程中 其成骨能力如何发挥、细胞演变的最终归宿如何等等问题产生 了浓厚的兴趣。对成纤维细胞成
9、骨能力的研究也正是开始于对 骨折愈合过程中成纤维细胞表现的观察。 对骨折局部骨形成区的电镜观察显示,除了成骨细胞在此 发挥成骨作用外,成纤维细胞确实也存在着类似的成骨表现 4,5,913 。例如,在其线粒体内可清晰见到钙盐颗粒, 部分内质网腔内可见成熟的胶原纤维,分泌到其四周的胶原纤 维内可见高密度的钙盐结晶沉积。不仅如此,成纤维细胞还能 象成骨细胞一样产生基质小泡并引起小泡内的钙盐沉积。钙化 的基质小泡形成丛毛球状的钙球,钙球随后合并、融合为骨组 织。以上种种现象表明,成纤维细胞与成骨细胞一样具备提供 钙盐沉积及骨形成所必需的条件。在从纤维性骨痂到骨性骨痂 的演变过程中,成纤维细胞也随之演变
10、为骨细胞,与成骨细胞 的归宿相一致。但二者在演变过程中的表现又不尽相同,主要 有以下几点可资鉴别9,13:成纤维细胞及其细胞核均呈 不规则的椭圆形或长方形,而成骨细胞及其细胞核则为边缘比 较光整的椭圆形;成纤维细胞均单独存在,细胞之间有众多 的胶原纤维相隔,成骨细胞则以连续排列的形式出现;成纤 维细胞的细胞质内溶酶体少见,而成骨细胞的细胞质内则常有 第 7 页 溶酶体可见;成纤维细胞四周的骨组织都由丛毛球状钙球或 针状钙盐结晶组成,成骨细胞则都有一面紧贴比较成熟与致密 的骨组织;成骨细胞是一个一个地被骨组织(类骨质)包围变 为骨细胞,而成纤维细胞则可以是两个或两个以上同时被骨组 织包围在一个陷
11、窝内,然后再随着细胞之间基质的钙化而分隔 为各占一个骨陷窝。 对成纤维细胞的成骨作用,有学者认为这是成纤维细胞的 固有特性在骨折这一特定情况下得以表达的结果9,11 。骨 折局部活的和失活的骨组织及软骨组织,以及骨基质中的某些 大分子都有可能诱导成纤维细胞表达其成骨作用进而演变为骨 细胞14,15 。较早在骨基质中发现的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)即对成纤维细胞有一定的诱导作 用。对骨折愈合中 BMP 作用的研究16,17 ,表明创伤使内源 性 BMP 呈阶段性合成与释放,并诱导周围软组织中的间充质细 胞或/和成纤维细胞等向成骨方向转化。应用
12、 PAP 法发现16 , 骨折后第 3、5 天局部纤维肉芽组织中的成纤维细胞样间充质细 胞内以及第 14 天新生骨小梁间纤维组织中的成纤维细胞样间充 质细胞内,都与成骨细胞、软骨细胞和骨基质一样存在 BMP, 表明这些成纤维细胞样间充质细胞已被诱导为可合成分泌 BMP、具有成骨作用的细胞。而 Sampath15从牛骨基质中分 第 8 页 离提纯得到的成骨素对成纤维细胞的骨诱导能力更是超过了 BMP 和当时已知的其它骨生长因子。 成纤维细胞在其成骨作用得以表达后,可能通过两种方式 成骨:膜内成骨;在环绕软骨的纤维层内成骨。开始分泌 胶原纤维后,参与成骨的成纤维细胞只有两个归宿 4,5,9,13:
13、变性、死亡、碎裂直至消失,这种演变发 生早、范围广,故从纤维性骨痂形成开始,就逐渐有基质成分 发生钙化,进而转变为骨基质;演变为骨细胞,这一过程出 现较晚,并穿插在前一过程之中,故在形成骨组织的细胞成分 的同时,还使丰富的纤维骨痂演变为骨性骨痂,形成骨组织。 但这种由成纤维细胞演变成的骨细胞,其结局如何、其生物学 特性与由成骨细胞演化而来的骨细胞是否相同仍不清楚。例如, 骨细胞从骨陷窝脱离后,可恢复为功能活跃的成骨细胞,再次 参与骨组织的形成;而由成纤维细胞演变成的骨细胞在脱离骨 陷窝后,是成为成骨细胞还是恢复为成纤维细胞、此时是否还 具备成骨作用等一系列问题尚缺乏研究。 5 成纤维细胞体外培
14、养的生物学特性18 第 9 页 成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用,而主要 是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在 体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。 由于皮肤成纤维细胞易于获取,又易于在体外生长,故目前皮 肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛 的运用,其分离培养技术已相对成熟,对其体外生长规律也有 了较全面的认识。 成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法,其中组 织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍。通常, 以酶消化法获得的成纤维细胞悬液在接种后 510min 即可见细 胞以伪足初期附着,与底物形成一些接触点;然
15、后细胞逐渐呈 放射状伸展,胞体的中心部分亦随之变扁平;最快者大约在接 种后 30min,细胞贴附底物即较为完全,呈现成纤维细胞的形 态。采用组织块法则大约在接种后 23 天2,3到 1 周左右, 在接种的皮肤组织块周围长出细胞。待细胞融合成片,铺满培 养容器底壁大部分时即可进行传代。一般都采用胰蛋白酶 (trypsin),将成纤维细胞从底壁消化下来后分瓶作传代培养。 成纤维细胞在体外培养条件下能保持良好的分裂增殖能力。细 胞分裂时变为球形;分裂后又平铺在附着物的表面成为有突起 第 10 页 的扁平细胞。体外培养的成纤维细胞,其生命期限与物种等因 素有关。例如:人胚成纤维细胞约可培养 50 代;
16、恒河猴皮肤成 纤维细胞能传代超过 40 代;鸡胚成纤维细胞则只有少数能培养 30 代;而小鼠成纤维细胞多数只能生长 8 代左右。另外,从老 年个体取得的成纤维细胞的寿命要比取自年轻者短。由于在细 胞传代和进行体外培养时,细胞的生物学特性会逐渐发生一些 不同于体内的改变,故通常只将前 10 代视这正常细胞,可在此 时将生长旺盛的成纤维细胞冻存起来,以备将来复苏使用,这 在将培养的细胞由动物实验向人体实验过渡的过程中必须给予 足够的重视。 6 成纤维细胞在体外培养中的成骨作用 徐荣辉2等通过体外培养家兔皮肤成纤维细胞发现,经 传代培养的成纤维细胞至第 8 天时,其细胞集落中有不透光的 骨小结节形成
17、;到 37 天时,小结节扩大、延伸,形成骨小梁样 结构。经活体四环素标记显示,所形成的结构为新生骨组织。 他们还注意到,成纤维细胞在参与骨形成的过程中并无分化为 成软骨细胞或成骨细胞的明确迹象,故推测并未发生此种分化, 而成纤维细胞之所以能发挥成骨作用,很可能是受某些诱导因 第 11 页 素作用的缘故。他们认为用以培养成纤维细胞的中厚皮片中混 杂存在的上皮细胞(或/与内皮细胞),可能是诱导成纤维细胞形 成骨组织的一种诱导因素。而 Friedenstein6,19较早的 实验则认为,属于诱导性骨祖细胞之一种的成纤维细胞,在上 皮细胞(如膀胱上皮)或脱钙骨基质等诱导因子作用下,可以分 化为成骨细胞
18、进而形成骨组织。邓廉夫20等分离培养取自 关节内的损伤性和晚期骨关节炎性的滑膜细胞,发现其中的成 纤维细胞样细胞增殖迅速,呈束状或交叉铺展并可形成多层结 构,细胞表面有其分泌物形成的不透光结节,经四环素标记、 ARS(Alizarinred s)和甲苯胺蓝(Toluidine blue)染色,显示 结节为新生骨组织。在缺乏常规的诱导因子上皮细胞的作 用下,取自滑膜的成纤维细胞样细胞也能发生成骨作用,他们 推测是在关节损伤后或骨关节炎的发生与发展过程中,改变的 关节微环境(如 TNF 样活性物质增多等)可能会触发滑膜的成纤 维细胞与骨形成相关的多基因表达,使其向成骨型细胞分化, 这样,滑膜成纤维
19、细胞样细胞在体内时即已具备成骨性能,故 在培养条件下可发挥成骨作用。Dodda21等的研究则指出, 变性滑膜细胞多种细胞因子和生长因子的表达、关节液内多种 细胞因子的出现,可能是滑膜成纤维细胞样细胞成骨表型表达 的重要始动因素。这些相关的研究表明成纤维细胞成骨表型的 表达可能存在着较复杂的调控机制,而其诱导因素也是多样的。 第 12 页 为获取大量具有成骨表型的成纤维细胞并了解其转化机制, 邓廉夫22等将分离纯化的人皮肤成纤维细胞置于加有不同 浓度 EGF、IL-6、TNF-、BMP-2 的培养液中进行体外培养,采 用生物化学、组织化学和电镜观察等方法检测成纤维细胞成骨 性标记物的形成状况,发
20、现 TNF- 和 BMP-2 联合应用,可使成 纤维细胞分泌碱性磷酸酶、骨钙素及胶原纤维的量增加;成纤 维细胞可由梭形向圆形或多突形转化,蛋白分泌旺盛;细胞外 基质中,丰富的胶原纤维定向或杂乱排列,其间散在较多的钙 颗粒;细胞可重叠交织形成多层结构,其表面有分泌颗粒和钙 盐结晶堆积,并不断融合扩大成骨结节,表明 TNF- 和 BMP-2 可以诱导成纤维细胞成骨。但这种完全由成纤维细胞经诱导而 形成的骨组织,在缺乏典型的成骨细胞参与下是否能在体外或 植入体内后经改建成为成熟的板层骨及其改建过程如何?仍有待 进一步研究。 7 展望 尽管成纤维细胞受哪些因素诱导可以产生成骨作用、这些 第 13 页
21、因素的诱导方式及其机制如何以及成纤维细胞在骨形成中是否 分化为成骨细胞等等问题尚未完全解决,但成纤维细胞经诱导 可以形成骨组织这一现象已逐渐为广大科学工作者所接受。由 于成纤维细胞直接参与了骨折愈合过程中纤维性骨痂的形成, 其自身又具备被诱导成骨的能力,可以设想,利用成纤维细胞 分布广泛、取材方便、对机体损伤较小、体外培养容易成活、 增生繁殖较快等较其它具有成骨作用的细胞(如骨膜成骨细胞、 骨髓基质细胞等)优越之处,在体外大量培养扩增成纤维细胞, 并施以有效的诱导因素(如上皮细胞、TNG- 和 BMP 等)使其具 备成骨效能,然后与合适的生物材料载体复合,同时使该复合 体在体外或体内保持良好的成骨能力并进行一定程度的成骨, 则有望获得具有一定的生物力学支撑强度而成骨作用又保持活 跃的“活骨”复合体,用以替代自体骨或异体骨回植体内治疗 难以自身修复的较大的骨缺损,这无疑将为骨缺损的修复治疗 开辟一条新的有辉煌前景的道路。在组织工程技术和生物材料 科学已有较大发展的今天,这一设想是极有可能实现的。当然, 从目前所处的实验阶段过渡到临床应用尚有很大一段距离,需 要解决的问题还很多,而且随着研究的展开和深入,问题可能 还会越来越多,但这确实是一项很有临床应用价值和社会、经 济效益的重大课题,值得广大基础医学工作者和临床科研人员 为之而努力。 第 14 页
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