荧光探针技术测定细胞内离子浓度【专业材料】.ppt
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1、荧光探针测定细胞内离子浓度技术,陶 亮 中山医学院药理教研室,1,专业知识,细胞内离子,cytoplasm,Na+,Cl-,Ca2+,K+,Fe2+,2,专业知识,细胞内离子的生理功能,细胞结构的组成成分 血红蛋白中Fe2+、超氧化物歧化酶中Cu2+ 维持细胞膜电位 K+、Cl-、Na+ 、Ca2+ 维持胞内外渗透压 Na+ 协同转运葡萄糖等营养物质 排泄代谢产物,3,专业知识,细胞内离子浓度异常与疾病,4,专业知识,细胞内Ca2+异常与疾病,高血压,骨质疏松,癫痫,5,专业知识,细胞内Na+异常与疾病,心律失常,猝死,6,专业知识,细胞内K+异常与疾病,惊厥,阵发性舞蹈手足徐动症,7,专业知
2、识,细胞内离子浓度测定意义,预防疾病的发生 提高疾病诊断的准确性 增强治疗疗效,8,专业知识,常用细胞内离子浓度测定方法,9,专业知识,常用测定方法,原子吸收光谱法 微量金属元素的测定:Na、K、 Ca2+ 化学滴定法 有机化合物与离子可产生颜色变化 如:Ca2+可使铬黑T由蓝变红,使钙盐指示剂 钙红从蓝变为酒红。 放射性标记法放射性标记目标离子,如45Ca 微电极法 荧光探针法,10,专业知识,其他新技术,核磁共振法NMR,不同脲素浓度下, 通过监测1H, 15N信号强度变化监控 MMP-12 折叠过程,11,专业知识,其他新技术,生物芯片技术,荧光强度反应荧光标记抗体与相应抗原结合程度,L
3、uis A. Rivas, et.al. A 200-Antibody Microarray Biochip for Environmental Monitoring: Searching for Universal Microbial Biomarkers through Immunoprofiling,12,专业知识,荧光探针,荧光:某些物质吸收了与它本身特征频率相同的光量子后,其原子中的电子被激发到较高的能级,从而产生吸收光谱,有些物质,当用紫外线照射时,它吸收了某种波长的光后还会发射处各种颜色和不同强度的光,而当紫外线停止照射后,这种光也随之消失,这种光称之为荧光。 分类:自发性荧光:
4、组织在短波长光照射下自行发射出的荧光,如组织中蛋白质和酯类在紫外线照射下发出微弱的淡蓝色荧光; 诱发荧光:组织与荧光色素结合后,经一定波长的光线照射后发出的荧光 荧光探针:常用的诱发荧光,能产生荧光的生物染色剂称之为荧光染料或荧光探针,13,专业知识,荧光探针技术的应用,14,专业知识,pH测定,Guoliang Ke,et.al. A Cell-Surface-Anchored Ratiometric Fluorescent Probe for Extracellular pH Sensing,pH在6.0-8.0时,不同pH值,荧光探针具有不同荧光强度,15,专业知识,细胞间通讯GJIC检
5、测,16,专业知识,标记活细胞线粒体,线粒体荧光探针,骨架蛋白,Merge,Abhik Mallick,et.al. Dual Drug Conjugated Nanoparticle for Simultaneous Targeting of Mitochondria and Nucleus in Cancer Cells,17,专业知识,DNA标记,通过XRay检测口服有机硅修饰PI荧光探针的口服吸收过程,Michihiro Nakamura, et.al.Thiol-Organosilica Particles Internally Functionalized with Propidi
6、um Iodide as a Multicolor Fluorescence and Xray Computed Tomography Probe and Application for Non-Invasive Functional Gastrointestinal Tract Imaging,18,专业知识,细胞膜电位检测,Jihoon Kim,et.al. Rapid Cytotoxicity Screening Platform for Amyloid Inhibitors Using a Membrane-Potential Sensitive Fluorescent Probe,细
7、胞凋亡时,膜电位改变,膜结合荧光探针的强度反应细胞凋亡程度,19,专业知识,荧光探针技术测定过程,荧光探针的负载 荧光探针与目的离子结合 荧光强度检测:荧光显微镜、流式细胞术、双波长荧光光度计,20,专业知识,荧光探针应用条件,负载:探针必须局限于要测定离子浓度的区域,最常见 的部位是细胞液,但有时为线粒体; 校准:探针的荧光强度必须与游离离子浓度定量相关,21,专业知识,荧光探针的负载,大量负载: AM酯负载 酸负载 ATP诱导渗透 阳离子脂质体递送 电穿孔 低渗休克 单细胞负载 显微注射法 膜片钳技术 微量电泳法 压力注射法,22,专业知识,荧光探针的负载 AM酯负载,AM负载技术:Ca2
8、+及其它阳离子探针的羧基和PH探针的酚 羟基被分别衍生为乙酰甲酯或乙酸酯,使探针可透过细胞膜并对离子不敏感,一旦进入细胞内,这些衍生的探针就可被普遍存在的细胞内酯酶水解,释放出离子敏感的多阴离子探针 不足: 区室化:细胞内膜包结构聚集 AM酯不完全水解 渗漏:有机离子载体、P糖蛋白多药载体等排除胞外,23,专业知识,荧光探针的负载 AM酯负载,24,专业知识,离解常数Kd:将荧光信号转化为离子信号的关键转换参数 校准过程:记录对应于精确控制的离子浓度的荧光信号,通过换算计算出解离常数Kd,,荧光探针的校准,25,专业知识,荧光探针技术检测Ca2+,26,专业知识,Ca2+荧光探针分类,紫外光激
9、发的荧光Ca2+探针 可见光激发的荧光Ca2+探针 荧光Ca2+探针交联物 生物性发光Ca2+探针,27,专业知识,紫外光激发的荧光Ca2+探针,高亲和力的钙探针:Fura-2, Indo-1及其衍生物 Fura-2成像显微镜首选 Indo-1流式细胞术首选 中等亲和力的钙探针: Fura-4F、Fura-5F、Fura-6F、Fura-FF、Indo-5F 低亲和力的钙探针: BTCBTC-AM,Mag-Fura-2、Mag-Fura-5、Mag-Indo-1 金鸡纳皮素(Quin)-2和Quin-2 AM 吸收率和量子产率比低,主要用来耗竭胞质液中游离Ca2+,确保单向性Ca2+内流,28
10、,专业知识,可见光激发的荧光Ca2+探针,高亲和力的钙探针: Fluo-3、Fluo-4、Rhod-2和相关的衍生物 基于Fluo-3和Rhod-2的低亲和力的钙探针: Fluo-5F、Fluo-4FF、Fluo-5N、Mag-Fluo-4、Rhod-5N 钙绿Calcium Green、钙橙Calcium Orange、钙深红Calcium Crimson探针 Fura Red探针 钙黄绿素Calcein,29,专业知识,荧光Ca2+探针交联物,葡聚糖交联物:Fura、Fluo-4和Indo葡聚糖 水溶性,低毒性,无生物活性 抵抗内源性糖苷酶的裂解 极少区室化 很好的存在于活细胞内 亲脂性衍
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