Miox基因在爪蟾胚胎发育中的时间和空间表达谱分析.doc
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1、Miox 基因在爪蟾胚胎发育中的时间和空间表达谱分析 傅小娟 1,陈雪梅2,周钦3,杜晓刚1* 1,重庆医科大学第一附属医院肾脏内科,重庆 400016 2,重庆医科大学第一附属医院急诊科,重庆 400016 3,四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室遗传工程与小鼠中心,成都 610000 摘要摘要 目的目的 研究 Miox 基因在物种进化及爪蟾胚胎发育过程中的时间和空间表达的分布特点。方法方法 利用半定 量 RT-PCR 观察 Miox 在爪蟾胚胎发育过程中的时间表达模式,利用整体原位杂交的方法(WISH)观察 Miox 基因在爪蟾 胚胎发育过程中的空间表达模式。 结果结果 RT-PCR 结
2、果显示 Miox 基因在胚胎发育第 26 期以前都没有表达,到胚胎发育 第 28 期开始有微量表达,随着胚胎的发育表达量逐渐增高,到胚胎发育第 40 期 Miox 表达明显升高,在第 41 期表达最高, 到胚胎第 45 期表达有所下调。与胚胎第 28、34 期相比,第 40、41、,45 期表达明显上调(P0.05);与胚胎第 40 期相比, 第 41 期表达明显上调(P0.05);然而,同胚胎第 41 期相比,第 45 期表达又明显下调(P0.05)。WISH 发现在 30 期以前 都没能检测到 Miox 在爪蟾的任何器官有表达,但从 33 期开始, Miox 在爪蟾前肾有很微弱的表达, M
3、iox 的表达随着发 育的进展逐渐增高。WISH 结果同 RT-PCR 结果相类似,直到第 3940 期,Miox 的表达量才明显升高,并且在随后的时 期都以同样高的水平表达。另外我们还发现,Miox 基因在爪蟾胚胎发育过程中均仅仅在原肾小管表达。结论结论 Miox 是一 个肾脏特异性基因,对于研究肾脏发育可能提供一个特异性标记。 关键词关键词 Miox;爪蟾;肾脏发育;表达模式 中图分类号中图分类号 R 394.1 文献标识码文献标识码 A Identification the Temporal and Spatial Expression Patterns of Miox in the E
4、volution of Xenopus laevis Embryos FU Xiao-juan1,CHEN Xue-mei2,ZHOU Qin3,DU Xiao-gang1* 1. Department of Nephrology, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China 2. Department of Emergency, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chong
5、qing 400016, China 3. Core Facility of Gene Engineered Mice, State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610000,Sichuan,China Abstract Objective To identify the molecular evolution of Miox and its temporal and spatial expression patterns in
6、the evolution of Xenopus laevis embryos. Methods The temporal and spatial expression patterns were analyzed by semi-quantitative reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) and whole-mount in situ hybridization, respectively. Results We investigated the temporal expression pattern of Miox during embryogene
7、sis of Xenopus laevis by RT-PCR and found that hardly any expression was detected before stage 26. Miox firstly expressed at stage 28 with a very small amount. Its expression level gradually increased along with the development of the process and reaced its peak at stage 40 and kept a high stable le
8、vel in later period. Compared with stage 28,34,the expression of stage 40,41,45 were upregulated significantly(P0.05) .Compared with stage 40,the expression of stage 41 was upregulated markedly(P0.05).But compared with stage 41,the expresssion of stage 45 was downregulated(P0.05).The results of 基金项目
9、基金项目 国家自然科学基金(81202318,81370816),国家重点基础研究发展计划(“973”计划,2011CB944002),重庆自 然科学基金(cstc2012jjA10136).Supported by National Natural Science Foundation of China (81202318,81370816), National Key Basic Research Program of China (“973” Project,2011CB944002),Natural Science Foundation of CQ CSTC (No.cstc2012j
10、jA10136). 作者简介作者简介傅小娟,硕士生.E-mail: *通信作者通信作者(Corresponding author).Tel:023-89012316,E-mail: whole-mount in situ hybridization showed that Miox started express at stage 33 and the expression trend was consistent with RT- PCR. We also found that Miox only expressed in the pronephros tubules in the whol
11、e procss of embryo development. Comment t1: 换算为 1000g Comment t2: 换算为 1000g Comment t3: 换算为 1000g Conclusion Miox was tissue-specific in Xenopus laevis pronephros development, which may provide a marker for later pronephros development in the study of organogenesis. Key wordsMiox; Xenopus laevis; ki
12、dney development; expression pattern 肌醇加氧酶(Myo-inositol oxygenase,Miox) 最初是在大鼠肾脏提取物中发现并纯化,但是从大鼠肾脏分 离得来的Miox蛋白并不稳定,因此关于这个蛋白的机制及特性研究进展很慢。直到20世纪80年代,有人 用电泳分离的方法才得到纯度较高的蛋白1。肌醇(Myo-Inositol,MI)是生理肌醇的异构体,在许多组织和 细胞中作为第二信使合成的前体而被利用,同时还可以作为一种有机渗透物质参与渗透压调节2。MI代 谢的第一个限速步骤就是受到Miox这个单氧酶的催化,而这个过程主要在肾皮质的近端小管发生3。 M
13、iox催化MI分解的酶促反应主要氧化裂解MI环状分子的第6位和第1位碳原子之间的键并产生D-葡糖醛酸 (D-glucuronic acid),形成的D-葡糖醛酸在随后的一系列步骤中逐步分解,并最终进入磷酸戊糖途径进行 循环代谢。研究发现,Miox在小鼠肾小管中近端小管表达明显高于其他器官。此外,Miox在糖尿病并发 症器官(如神经组织、视网膜等)中也有少量表达4-7。然而关于Miox在胚胎发育中的作用至今尚未见报道。 本研究通过半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和整胚原位杂交的方法观察Miox在爪蟾胚胎发育过程 中的时间和空间表达谱,为以后研究Miox在肾脏发育过程中的作用提供理论基础。
14、 1材料和方法 1.1 主要试剂 实验所需爪蟾由四川大学华西医院遗传工程小鼠中心馈赠。RT-PCR试剂盒、HindIII 和BamHI限制 性内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、T3和T7 RNA聚合酶均购于Fermentas公司。地高辛标记的 UTP、Anti-digoxigenin-AP及Purple AP Substract均购于罗氏公司。 Trizol购于Invitrogen公司,PCR 引物 合成和DN A 测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。羊抗地高辛碱性磷酸酶标记的抗体及封闭 用正常羊血清购于北京中杉金桥生物技术有限公司。 1.2 爪蟾胚胎的获取及制备 向成熟
15、的非洲爪蟾背部注射500800 IU的人绒毛膜促性腺激素(HCG)促进排卵。体外受精后的胚胎, 用2%的盐酸半胱氨酸(pH 7.88.0)进行脱膜,将脱膜以后的受精卵培养在0.1 MBS ( pH 7.4)缓冲液中。 用于原位杂交的胚胎将固定于1 MEMFA缓冲液+3.7%多聚甲醛(固定11.5 h)。固定后的胚胎经过不同 浓度甲醇处理(25%的甲醇处理5 min, 50%的甲醇处理5 min, 75%的甲醇处理5 min, 100%的甲醇处 理5 min) ,梯度脱水。 。脱水后的胚胎保存在-20的冰箱中。 1.3 RT-PCR检测Miox表达 分别收集爪蟾第1、3、7、11、17、20、2
16、2、26、28、34、38、40,、41、45期共14个时期的胚胎,将 收集的胚胎放入研钵,加入少量液氮迅速研磨,将研磨的组织转入1.5 mL 离心管,按50100 mg组织 /mL Trizol,反复吹打,室温放置5 min使其充分裂解;4离心机1000g离心10 min;将上清液转移到新的离 心管中,加入200 uL氯仿(按照200 uL氯仿/1 mL Trizol比例),振荡混匀,室温放置15 min;4离心机1000g 离心15 min;离心后可以看到混合物被分为3层,吸取上层水相至一新的离心管中;加入500 uL异丙醇(按 照500 uL异丙醇/1 mL Trizol的比例)混匀,室
17、温放置510 min;4离心机以不超过1000g的速度离心10 min,此时在管底可见微小白色沉淀,丢弃上清液;加入1 mL 75%乙醇(按照1 mL 75%乙醇/mL Trizol比例), 温和振荡悬浮沉淀;4离心机以不超过7500g的速度离心5 min,丢弃上清;重复一次;室温干燥RNA 510 min,用30 uL DEPC水溶解沉淀,测定浓度并放置在-20保存。将RNA反转录为cDNA,采用PCR 扩增包含大部分编码区及部分 Comment t4: 用 Image J 对凝胶图像 进行灰度扫描,并进行统计学分析 Comment s5: 冠状位切片 Comment s6: 在 ZEISS
18、 AxioCam MRc5 体视镜下观察并拍照。 3端非翻译区的Miox基因cDNA序列( 扩增片段长度为896 bp)。引物序列(上游引物5 GCAAGCTTGTGTTCAGTGACACCA3,下游引物 5GCGGATCCAATCTTCACAATCCTC3)。扩增条件: 95预变性2 min;94变性30 s, 55退火30 s, 72延伸 1 min, 共35个循环;最后72 延伸10 min。将 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后,在凝胶成像系统下观察基因在各个时期的表达情况。用Image J对凝 胶图像进行灰度扫描,并进行统计学分析 1.4 胚胎整体原位杂交检测Miox表达 将Miox
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