拟南芥Alpha_dioxygenase1的原核表达_纯化及活性的检测.pdf
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1、收稿日期:2008 - 02 - 13 基金项目:国家自然科学基金(30300222) ;西北农林科技大学优秀人才基金(042R009) 作者简介:张小梅(1979 - ) ,女,陕西大荔人,硕士,主要从事生物化学与分子生物学研究。 通讯作者:范三红(1971 - ) ,男,陕西合阳人,副教授,主要从事植物分子生物学研究。 拟南芥Alpha2dioxygenase 1的原核表达、 纯化 及活性的检测 张小梅1 ,2,韩念法1,张美祥1,李广录2,范三红1 ,3,郭蔼光1 ,3 (1. 西北农林科技大学 生命科学学院,陕西 杨凌 712100;2.河南科技大学 农学院,河南 洛阳 471003;
2、 3.陕西省农业分子生物学重点实验室,陕西 杨凌 712100) 摘要:从经水杨酸处理的拟南芥开花期植株中获得cDNA ,扩增得到Alpha2dioxygenase 1(DOX1)基因,进行原核表 达、 纯化和生物活性检测。利用原核表达载体pMAL2c4x在T7 Express CompetentE. coli和BL21(DE3)2RIPL codon+菌株 中表达DOX1,经Amylose Resin亲和层析柱纯化。SDS2PAGE结果表明,重组融合蛋白在BL21(DE3)2RIPL codon+中的 表达通过灰度值比较分析以可溶性为主,表达率约3. 7 % ,纯化的DOX1纯度可达45 %
3、。愈创木酚法表明,可溶性重 组蛋白不具有过氧化物酶活性;2 ,42DNP法测试表明可溶性重组蛋白具有脂肪酸双加氧酶活性。 关键词:Alpha2dioxygenase 1;重组表达;2 ,42DNP;亲和纯化;活性 中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:1000 - 7091(2008)03 - 0009 - 04 Expression ,Purification and Activity Analysis of Arabidopsis2dioxygenase 1 ZHANG Xiao2mei1 ,2,HAN Nian2fa1,ZHANGMei2xiang1, LI Guang2lu2
4、,FAN San2hong1 ,3,G UO Ai2guang1 ,3 (1. College of Lifesciences ,Northwest Agriculture and Forestry University ,Yangling712100 ,China ; 2. College of Agronomy ,Henan University of Science and Technology ,Luoyang471003 ,China ; 3. Key Laboratory for Molecular Biology of Agriculture of Shaanxi Provinc
5、e ,Yangling712100 ,China) Abstract :RecombinantDOX1was cloned into pMAL2c4x expression vector and expressed inE. coliT7 Express CompetentE. coliand BL21(DE3) RIPL codon + . Purified using amylose resin column ,a fusion protein about 114 kD was detected by SDS2PAGE in the IPTG induced recombinant BL2
6、1(DE3) RIPL codon + strain ,and its yield accounts for 317 % of the total bacterial proteins ,the purityof recombinant protein was about 45 %. The soluble fusion protein had un2 detectable peroxidase activity by the guaiacol method;The alpha dioxygenase activityof the purified protein was tested us2
7、 ing 2 ,42DNP ,result showed that the soluble fusion protein had detectable alpha2dioxygenase activity. Key words :Alpha2dioxygenase 1 ;Recombinant expression;2 ,42DNP;Affinity purification;Activity 生物在长期的进化过程中,形成了独特的一套 响应外界环境胁迫的生理及生化过程。这个适应性 包括了一系列复杂的过程:如胁迫信号的受体感应、 细胞间的信号传递、 细胞内信号级联放大效应、 基因 的表达调控模式
8、改变、 胁迫后恢复正常状态的调节 等。特别是在信号传递及基因表达调控方面,多不 饱和脂肪酸氧化物具有重要的作用。而合成脂氧化 物等信号分子的主要代谢途径为脂肪酸的加氧反 应。Alpha氧化是高等植物体内脂肪酸氧化降解的 辅助途径。催化脂肪酸Alpha氧化的酶是一种双加 氧酶,1998年在病原入侵的烟草叶片中首次克隆到 该 基 因,命 名 为PIOX( Pathogen induced oxyge2 nase) 1。根据在重组烟草 PIOX及拟南芥中同源的 加氧酶分析表明,该酶为alpha双加氧酶( 2 dioxyge2 nase) 2。在拟南芥中 2dioxygenase 有2个同源基 因,分
9、别命名为 2dioxygenase 1(DOX1) 2和 2dioxy2 genase 2(DOX2) 3。拟南芥 DOX1参与病原微生物 入侵时的防御反应4 ,5,能够催化脂肪酸Alpha氧化 的第一步反应,将脂肪酸氧化生成Cn21烷醛。本研 华北农学报2008 ,23 (3) :9212 究利用pMAL表达系统,研究了DOX1在大肠杆菌 中的可溶性表达,并对重组蛋白进行了初步的活性 鉴定,为后续工作的开展奠定了基础。 1 材料和方法 1.1 材料 pMAL2c4x载体和Amylose Resin亲和层析柱为 NEB公司产品(美国) ;pPCR2script Amp SK( + )载体 为本
10、实验室保存;Ligation Kit Version 2. 0 Taq DNA Polymerase , primeSTAR HS DNA Polymerase , Protein Marker及内切酶购自Takara公司(大连) ;Trizol购自 上海英骏公司; T7 Express CompetentE. coli,BL21 (DE3)2RIPL codon + 、JM109等菌株为本实验室保 存;DNA Maker,琼脂糖凝胶回收试剂盒,质粒提取 试剂盒均购自天根公司(北京 ) ; 引物由上海英骏公 司合成,测序由北京博尚公司完成。 1.2 方法 1.2. 1DOX1基因的克隆及原核表
11、达载体的构建 开花期拟南芥经0.1 %水杨酸4 ,6处理后第3天, 取1 g植株,加液氮研磨,加1 mL Trizol试剂提取总 RNA ,按照说明书操作。以拟南芥花期整株总RNA 为模板,以oligo dT为引物反转录合成cDNA第一 链。以合成的cDNA第一链作为模板,根据DOX1 全长cDNA序列设计引物进行PCR扩增,上下游引 物分别引入Xba 和Pst 的酶切位点。 上游引物:5 2TGCTCTAG AATG AAAGTAATTACTT CCCTAATC23 下游 引 物: 5 2AACTGCAGTTAAG AGGG AATTCG G AG23 扩增条件为:94 预变性5 min;9
12、4 变性45 s , 55 退火45 s ,72 延伸2. 5 min ,30个循环,72 延 伸5 min。用1 %的琼脂糖电泳检测并回收目的片 段,PCR扩增产物与经过EcoRV单酶切的pPCR2 script Amp SK( + )载体连接后测序,并命名为pPCR2 DOX1。用XbaI和PstI双酶切pPCR2DOX1,割胶回 收目的片段,再将其与相同酶消化回收的pMAL2c4x 载体连接,最后获得重组载体pMAL2DOX1。 1.2.2DOX1基因的诱导表达 将pMAL2DOX1分 别导入T7 Express CompetentE. coli和BL21(DE3)2 RIPL codo
13、n +感受态细胞。挑取单菌落接种于含 50 mg/ mL氨苄青霉素和34 mg/ mL氯霉素的LB培养 基中,37,200 r/ min过夜培养;以1500的接种量 接到2YT培养基中,扩大培养6 h左右,加入终浓度 为0.3 mmol/L的IPTG,20,诱导表达25 h。8 000 r/ min离心1 min收集菌体,加入上样缓冲液,煮沸8 min ,进行SDS2PAGE分析,考马斯亮蓝染色,观察 照相。 1.2.3 重组蛋白的可溶性分析及DOX1亲和纯化 大量诱导表达后的菌体经超声波裂解菌体,4 12 000 r/ min离心20 min ,分别保留上清和沉淀。上 清部分按照pMAL蛋白
14、纯化系统进行纯化,先上低 盐缓冲液平衡柱材,然后上清液上柱,重悬柱材,冰 浴30 min ,弃去流出液,15倍柱体积低盐缓冲液洗 脱,10倍柱体积高盐缓冲液洗脱,5倍柱体积低盐缓 冲液洗脱,2倍柱体积洗脱液洗脱,收集样品液。 SDS2PAGE检测对比上清、 沉淀及纯化结果。 1.2. 4DOX1过氧化物酶活性分析 根据上述反 应体系加样,用分光光度计测定470 nm处光吸收值 变化7(表 1) 。 表1DOX1过氧化物酶活性分析 Tab.1Peroxidase activity analysis ofDOX1 对照/ mL Control 样品/ mL Sample 0.1 % Guaiaco
15、l0.20.2 0.18 % H2O20.20.2 G lacialaceticacid2sodium acetate2.62.5 Sample-0.1 1.2.5 初步进行DOX1的 2dioxygenase活性分析 DOX1的 2dioxygenase活性通过间接测定其与脂肪 酸孵育得到的醛来分析7,以月桂酸为底物。反应 混合物包括10 mmol/L月桂酸/ 1 mol/L Tris2HCl , pH715 ,100L蛋白纯化产物,补水至总体积500L , 30 孵育30 min ,加入500L 2 ,42DNP醇酸溶液, 5030 min ,冰浴,加215 mL 10 %NaOH/ 80
16、 %乙醇, 20,1 300g 20 min ,420500 nm下进行吸光值扫 描8。 2 结果与分析 2.1pMAL2DOX1融合表达载体的构建 根据拟南芥DOX1cDNA编码区设计上下游引 物,上下游引物中分别包含Xba 和Pst 位点。用 高保真酶primeSTAR HS DNA Polymerase PCR扩增获 得2 kb左右的平末端目的片段(图12A) ,割胶回收 后直接克隆入pPCR2script Amp SK( + )载体,获得 pPCR2DOX1。将DOX1编码区从pPCR2DOX1中切 出并与pMAL2c4x载体连接,获得表达载体pMAL2 DOX1。 图12B为pMAL
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