第一部分核酸化学及研究方法.doc

高级生化科目复习参考资料考试说明：共两类题型 名词解释（12个，每个3分）；简答题（8个，每个8分）2014.01.09晚考名词解释和简答题平均每部分各两个题目，但申业老师讲的核酸和生物膜部分可能会多出1-2题。注：课程内容较多，整理起来比较繁琐，复习资料当中有些内容或许还不完全，作为复习参考吧第一部分：核酸化学及研究方法（申业老师） -橄榄枝整理名词解释：基因作图(gene mapping)：在一组基因中，如果每一对基因至少与同组内的另一对基因连锁，则称这样一对基因为一个连锁群，比较一个连锁群中的不同对基因之间的重组率，可以确定基因在染色体上的排列顺序，这个过程称基因作图。组蛋白密码( Histone Code)：组成核小体组蛋白的氨基末端游离于核小体之外，可以被共价修饰。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。尤其是组蛋白乙酰化、甲基化修饰能为相关调控蛋白提供在组蛋白上的附着位点，改变染色质结构和活性。发夹结构(Hairpins)：具回文序列的单链DNA或RNA形成的结构。回文结构( palindromic sequence)是指水平旋转180 ，再垂直旋转180 ，对称的序列结构位点特异性重组：当噬菌体DNA整合到大肠杆菌染色体中时会发生位点特异性重组，重组发生在噬菌体的attP 和大肠杆菌attB序列之间，重组由一种整合酶催化。问答题：1 述端粒延长的机制端粒是染色体末端存在特殊的序列，为简单的重复序列。端粒酶识别染色体突出的3端序列，与端粒序列互补的一段RNA序列是端粒酶复合物的一部分。前导链的悬垂部分与端粒酶RNA杂交，以RNA为模板在端粒酶作用下延长，接着端粒酶转移到前导链的末端。引发酶和DNA聚合酶最后延长端粒DNA的滞后链2 转座子类型及转座机制转座是一个DNA片段从基因组中的一个位置转移到另外一个位置的过程转座子：可移动的片段称转座元件或转座子转座子两种类型：转座子：编码一个或两个转座必须的基因产物，同时包括10bp长的反向重复序列，位于编码序列的两端。反转录转座子(retrotransposon):完成反转录需要经过RNA中间产物途径，编码反转录酶，以RNA为模板合成DNA中间产物机制：基因八P5293 核小体组蛋白有几种修饰以及与染色体活性之间的关系组蛋白修饰的种类：乙酰化：赖氨酸的乙酰化甲基化：赖氨酸和精氨酸的甲基化磷酸化：丝氨酸的磷酸化泛素化：赖氨酸的泛素化真核生物基因组活性主要取决核小体，不仅因为核糖体定位在DNA上，还因为组蛋白精细的化学结构。组蛋白乙酰化水平增加与转录活性增强有关，而组蛋白甲基化修饰的结果则相对复杂，它可以是转录增强或转录抑制。特定组蛋白羧基端的泛素化同样影响蛋白质的降解过程，从而也可调节基因的表达。目前研究还发现组蛋白修饰与CpG岛的甲基化密切相关。4 什么是转录因子，举2-3个例子说明常见转录因子的结构特征。转录因子：结合到特异顺式作用元件上的反式作用蛋白。一般含有两个结构域：一个用来识别和结合顺式作用元件，另一与其它参与转录激活蛋白的结合。碱性螺旋-转角-螺旋（basic helixloophelix，bHLH ）转录因子：bHLH 转录因子常形成二聚体，单体的前端有一段碱性氨基酸序列带正电荷的侧链与DNA相互作用，决定转录因子的序列特异性，两个单体的一个helix相互作用形成二聚体，另一个helix象剪刀一样插入到DNA双螺旋的大沟中。碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper, bZIP）：形成一个类似剪刀的二聚体，结合在DNA分子的大沟上，每个单体包含30- 40个氨基酸组成的螺旋，每隔6 个氨基酸含有一个Leu ，Leu 朝向同一方向，二聚体中Leu 相互面对，结构上将螺旋向拉链一样拉到一起，形成二聚体，并插入到DNA大沟中。锌指蛋白(zinc finger)：锌指蛋白带有2 -9 个突出部分，突出部分由一个锌离子和四个氨基酸（组氨酸和半胱氨酸），插入到DNA分子的大沟中。5 通过哪几种方法可以获得cDNA的全长？简述其原理。(1)RT-PCR（reverse transcription PCR ）：根据基因家族各成员间保守氨基酸序列设计简并引物，并用简并引物进行RT- PCR 扩增，得到该基因的部分cDNA序列，再利用RACE获得cDNA全长(2)cDNA 末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE ）：基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA 片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3端和5 端的方法。目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTECH的SMARTerTM RACE技术6 简述探针标记方法和原理随机引物法：利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新的DNA链。将6-8寡核苷酸片段与已变性的DNA单链或RNA模板退火，使该片段模板退火，使该片段随机互补结合在单链分子上，在 段随机互补结合在单链分子上，在大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段作用下，以同位素标记的作用下，以同位素标记的dNTP为原料，寡核苷酸为引物的 原料，寡核苷酸为引物的3 -OH端开始沿5 至3 方向，合成一条与模板互补的新DNA链。切口平移：胰DNA酶I 在DNA双链上随机切开若干切口， 双链上随机切开若干切口，切口处形成3 -OH末端。大肠杆菌DNA聚合酶I 以切口处开始作用， 以切口处开始作用，以另一条DNA链为模板。4 种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解5 端核苷酸和3 端修复加入标记核苷酸同时进行，切口平行推移。末端标记法： 5 端标记法 用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或RNA单链5 末端的磷酸基团，使其成为5 -OH，然后在（-35S）ATP 存在下，经T4噬菌体多苷酸激酶催化，将位上的35S转移到DNA或RNA分子的5 -OH末端，使DNA片段或RNA或寡核苷酸5 端均带35S标记。 3 端标记法 利用末端转移酶Terminal transferase (TdT )在单链或双链DNA的3 端催化核苷酸的合成。7 哪些方法可以在转录水平上检测基因表达的差异？简述其原理通过检测mRNA揭示基因转录水平的表达特征根据分析方法的原理和功能特性，可将基因表达分析分为：1）封闭性系统研究方法：例如DNA微阵列、Northern印迹、实时RT-PCR等方法，其应用范围仅限于已测序的物种，只能研究已知的基因。2）开放性系统研究方法: 如差异显示PCR、双向基因表达指纹图谱、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等，可以发现和分析未知的基因。 a.Northern 印迹杂交是应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术，主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小。b.反转录PCR可用于mRNA的半定量分析。是一种简单、快捷地对RNA进行定性、定量分析的方法。RT- PCR技术一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测RNA样品进行半定量分析。c.实时定量PCR：该方法是对PCR反应进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。d.基因芯片又称DNA微阵列， 是将大量已知序列的核酸片段（包括寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、microRNA等) 集成在同一基片上，组成密集分子排列，通过与标记样品进行杂交，检测、获取细胞或组织的基因信息。e.高通量测序技术是新一代基因表达谱分析方法，在RNA水平上，可以对RNA片段进行扫描、定量与鉴定，对全基因组进行广谱表达研究。哪些方法可以检测蛋白表达水平的差异？简述原理。通过蛋白质检测揭示基因翻译水平的表达特征1 Western印迹：是一种免疫印迹技术，以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质/多肽分子。2 双向电泳(2-DE)结合质谱：目前采用最多的是双向聚丙烯酰胺凝胶电泳结合质谱技术，根据蛋白质分子的两个属性等电点(pI)和分子质量将蛋白质混合物进行分离。第一向：等电聚焦电泳，依据蛋白质带净电荷数而非分子量进行分离；第二向分离：SDS-PAGE电泳，依据蛋白质的分子量进行分离9.试述“采用功能失活策略鉴定基因功能”方法和原理功能失活策略是通过观察细胞或个体的某一基因功能被部分或全部失活后，细胞生物学行为或个体遗传性状表型的变化，来鉴定基因的功能。（1）基因突变可以使基因的功能完全缺失基因敲除(gene knockout) ：利用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。此法可产生精确的基因突变，从而到基因敲除的目的。随机诱变(random mutagenesis) ：通过辐射、化学诱变剂或随机T -DNA插入使基因组产生随机诱变，从而使基因的功完全缺失。（2）基因沉默可以使基因的功能部分缺失RNA干涉（RNA interference，RNAi）：近年来研究发现，当一些小分子量的外源双链RNA进入寄主细胞后，便可促进与其同源的内源mRNA发生特异性的降解作用，从而高效而特异地阻断体内相应基因的活性，在细胞内发挥基因的剔除作用。分子机制：异常的单链RNA分子在RdRP作用下合成双链RNA(dsRNA)分子。Micro RNA (miRNA) 是内源的siRNA-like RNA ，参与了动植物发育相关基因的表达调控。miRNA的前体(pre-miRNA) 是颈环区域带有bulges 的小发卡RNA (small hpRNA )。所有的dsRNA，hpRNA 和pre-miRNA 都可以由Dicer加工成21 nt RNA 的双螺旋，21 nt RNA 的双螺旋和unwound ssRNA 掺入到RISC复合体中。植物中，dsRNA 和 pre-miRNA 可由不同的DICER-LIKE蛋白加工，动物中，miRNA与mRNA部分互补，抑制翻译。植物中，miRNA 类似于siRNA的作用，切割有可能不完全配对的mRNA。植物中有些miRNA也抑制翻译。反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASON ）也可引发基因沉默反义寡核苷酸是指能与mRNA 互补配对的RNA分子，长度一般为20nt 左右。反义寡核苷酸引发基因沉默的机制：（1 ）可能是通过与靶mRNA 互补结合后以位阻效应抑制靶基因的翻译；（2 ）也可能通过与双链DNA结合形成三股螺旋而抑制转录；（3 ）也不能排除通过激活细胞内的Dicer酶进入RNA干涉途径而降解靶mRNA 。10.试述酵母双杂交的原理它是利用酵母转录因子GAL4的特性建立的。许多真核生物的位点特异性转录因子是由两个相对独立的结构域组成，比如，GAL4由两个结构域组成：一个是N 端的 DNA结合结构域(binding domain,BD)：负责识别和结合其效应基因的上游激活序列。另一个是C 端的激活域(Activation domain,AD)：负责与DNA-BD结合形成完整的转录激活因子,招募RNA聚合酶并特异性激活UAS下游的效应基因表达。用目的蛋白 X 的核酸序列同 BD 的核酸序列融合，构建BD-X表达载体，称为“诱饵”（bait）。用目的蛋白 Y 的核酸序列同 AD 的核酸序列融合构建AD-Y表达载体，称为“猎物”或“靶蛋白”(prey or target protein) Y可以是cDNA文库，基因片段或基因突变体。如果 X 和 Y 相互作用, 则使 BD 和AD 两结构域在空间上靠近时, 激活其下游基因表达。11.试述双分子荧光互补验证的原理将荧光蛋白在某些特定的位点切开，形成不发荧光的N和C端2个多肽，称为N片段(N-fragment)和C片段(C-fragment)。这2个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发地组装成完整的荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发时不能产生荧光。但是，当这2个荧光蛋白的片段分别连接到一组有相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这两个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的2个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，并在该荧光蛋白的激发光激发下，发射荧光。简言之，如果目标蛋白质之间有相互作用，则在激发光的激发下，产生该荧光蛋白的荧光。反之，若蛋白质之间没有相互作用，则不能被激发产生荧光。哪几种方法可以检测蛋白质和DNA之间的相互作用，简述原理。(1)酵母单杂交技术（yeast one - hybrid）：由J. Li于1993年从酵母双杂交技术发展而来，是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法；通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因。(2)电泳迁移率变动实验( Electrophoreticmobility shift assay,EMSA )，是研究蛋白和DNA相互作用的一种技术。用放射性同位素标记待检测的片段（即探针DNA），然后与细胞提取物共温育，形成DNA-蛋白复合物，将该复合物加到非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。通常用32P标记DNA分子，而不标记蛋白质。电泳结束后，用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置。如果细胞蛋白提取物中不存在与同放射性标记的DNA探针结合的蛋白质，那么所有放射性标记都将出现在凝胶的底部；反之，将会形成DNA-蛋白质复合物，由于受到凝胶阻滞的缘故，放射性标记的DNA条带就会出现在凝胶的不同部位。(3) 染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation , CHIP ）：目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。