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第三章 主要生防微生物类群（生防细菌、放线菌、真菌）一、生防细菌Maarten 等(1997)报道常见的对植物病害有生防作用的细菌多集中在以下几个属：假单胞杆菌属(Pseudomonas) 包括荧光假单胞菌，土壤杆菌属(Agrobacterium)，欧文氏杆菌属(Erwinia)，伯克氏杆菌属(Burkholderia)，芽胞杆菌属(Bacillus)等。（一）荧光假单胞菌荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）属于假单胞杆菌属，是植物根际有益微生物中种群数量最大的一类革兰氏阴性菌，其营养需要相对简单、能够利用根分泌物中大部分营养迅速在植物根基定殖。同时因其中一些菌株具有促生和生防作用，使其成为最具有应用前景的植物根围促生细菌(Plant growth-promoting rhizobacteria PGPR)之一。近来年，国内外利用荧光假单胞菌防治土传病害的研究和应用都取得很大的进展(表1)。表1 目前在美国上市的荧光性假单胞菌类PGPRTable 1-1 Pseudomonas products for disease control in USA marketPGPR产品名防治对象应用作物制造/销售厂家荧光假单胞菌BlightBan A506霜冻、解淀粉欧文氏菌杏、苹果、蓝莓、樱桃、桃、李、马铃薯、草莓、番茄Plant Health Technologies荧光假单胞菌ConquerPseudomonas tolassii蘑菇Mauri Food荧光假单胞菌菌株NCIB2089VictusPseudomonas tolassii蘑菇Sylvan丁香假单胞菌ESC-10Bio-save100Bio-save-1000Botrytis cinereaPenicillium spp.,Mucor pyroformis,Geotrchum candidum果类（Bio-save100）柑桔（Bio-save100）Spawn Laboratory EcoScience Corp.丁香假单胞菌ESC-11Bio-save110同上梨果类EcoScience Corp.1 荧光假单胞菌的生防机制荧光假单胞菌作为PGPR与植物间的相互作用十分复杂。研究表明其促进植物生长多数是以病原菌存在为前提，抑制病原菌对植物根系的危害，间接促进植物的生长。生防荧光假单胞菌的作用机理多种多样，就目前已经肯定的机理，包括抗生作用、营养和位点竞争、诱导抗病性等等。（1） 营养和位点竞争不同的作物根际为微生物提供的可利用营养不同。有益微生物和病原菌之间竞争有限的营养物质必然会影响病原物的生长和致病性。Daniel等（1991）获得了荧光假单胞菌的突变株M114，它是蛋白酶缺失突变体，不能利用葡萄糖、海藻糖、葡糖酸、果糖，甘露醇和甘油，而且对琥珀酸，苹果酸和延胡索酸的利用方面有缺陷。突变体M114和野生型菌比较，在甜菜根际定殖能力无显著的差别。但与野生菌株相比，M114在甜菜的根际能够充分地利用各种不同的碳源营养。作物根际含有大量以植物和微生物不能利用的形式存在的铁元素。在根际土壤中，Fe(OH)3的溶解度非常低，有效铁Fe3+的浓度仅有10-17mol/L，远远不能满足微生物正常的生长需要(10-5-10-7mol/L)。因此，在微酸性、中性和碱性土壤中，有效铁Fe3+浓度都满足不了微生物正常生长需要的有效铁含量。大多数的微生物都能产生一种低分子量的、与Fe3+具有很高亲和力的物质，称为嗜铁素（Siderophore）。Klopper等（1980）首次发现和证明了荧光假单胞产生的嗜铁素作为一种作用机制在生物防治中具有重要作用。其将荧光假单胞菌野生菌株与化学诱变获得的不产嗜铁素的突变菌株分别与病原物接种在Fe3+贫乏的培养基中，发现野生菌株显著抑制病原菌的生长，而突变菌株对病原菌没有抑制作用。向缺铁介质中补加嗜铁素后，突变菌株则恢复了对病原菌的抑制作用。以上结论说明在铁胁迫条件下，荧光假单胞菌通过产生嗜铁素，在与病原物竞争铁营养的过程中占有优势，从而抑制了病原物的生长。此后许多研究表明在荧光菌对根际有害微生物，如小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis var. tritici）、镰刀菌枯萎病菌（Fusarium oxysporium spp.）和腐霉根腐病菌（Pythium spp.）的生物防治中产生的嗜铁素都有抑制病原菌的作用。进一步研究表明，植物根际的荧光假单胞菌产生的嗜铁素与三价铁离子形成复合体，可被荧光菌和植物利用，而病原菌则不能利用，因此其不能获得生长需要的铁离子，种群数量减少，致病力降低，而间接的保护了植物健康的生长。 根际生态位点的竞争是生物防治土传病害的另一个作用机制。大量研究证实，防病效果好的生防细菌，大多具有定殖能力强，能够分布于根的各个区域的特性。通过种子处理，假单胞菌极易定殖在植物根际，占领根际有效位点，对土传病害的防治效果明显好于将有益菌接种在土壤中。用不产生冰核的突变菌株（Ice-mutant of Pseudomonas syringae）与产生冰核的菌株同时接种植物预防霜冻。试验结果表明：由于植物叶面的生态位点有限，非致病突变体的定殖减少了致病群体的定殖，霜冻害有明显减轻。（2） 诱导抗性 诱导抗病性（induced resistance）是指利用物理、化学和生物方法，预先处理植物，诱导植物启动自身的防御机制，增强对后续病原物的抵抗能力。荧光假单胞菌的一些菌株能通过诱导植物产生对病原物的抗性，或通过产生某些物质诱导植物产生抗性。van Peer等（1991）用P. fluorescens WCS417r和病原菌F. oxysporum dianthi分别接种康乃馨（前者接种在根部，后者接种在茎部），WCS417r处理根部比茎部早接种病原物提前一个小时，枯萎病发病率从50%下降到20%，试验中WCS417r并未接触到病原物，其对枯萎病菌的防治不是通过二者之间的竞争和拮抗作用，而是诱导了寄主植物的抗病性。同时，用恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌的一些菌株处理青豆，黄瓜种子后，发现幼苗茎，叶上的病害症状都明显减轻，但在茎、叶部位并未分离到原接种的菌株。某些荧光假单胞菌产生HCN也能诱导植物产生抗性，Voisard 等人发现野生型P. fluorescens CHA0的HCN- 突变株失去了抑制烟草黑根腐病的能力。在烟草上已经确认HCN有诱导抗病的能力。用棉花枯萎病菌的无毒菌株或弱致病性菌株进行预先接种，24小时内即可表现交叉保护效果，接种无毒菌株的同时诱导了对维管束的堵塞和类萜的合成，堵塞作用造成棉花植株组织中病原菌数量的减少。目前，对植物根际有益菌诱导抗病性的研究结果表明：诱导抗病性的根际细菌在不同植物根际的定殖没有专化型，而产生诱导抗病性则对植物存在较高的专化型。恶臭假单胞菌WCS358r和WCS374r诱导抗病性的植物种类明显不同，WCS358r能够诱导拟南芥的抗病性，但对萝卜、康乃馨无诱导作用。根际有益菌诱导抗病性与病原菌诱导抗病性的机制明显不同。根际有益菌产生的脂多糖、嗜铁素和鞭毛蛋白是诱导抗性的决定因子。（3） 抗生作用产生抗生素 抗生素是由微生物产生的具有生物学活性的物质，它在很低浓度下就能抑制或影响其它生物的机能，从而对敏感微生物产生抑制或致死作用。大约在一百年前，欧洲科学家就发现了微生物间的拮抗作用。自从1877年，巴斯德发现一种细菌抑制另一种细菌的拮抗现象后，世界各国对利用微生物防治植物病害的研究发生了浓厚的兴趣。由于生防菌产生的抗菌素具备抑制病原菌微生物生长的能力，因此生防菌的拮抗作用在目前植病生防菌筛选中是最重要指标，产生抗生素与否及其产量大小往往决定着一个生防菌株的命运。在防治植物病害中起着重要作用的荧光假单胞菌在其生长环境中能分泌多种胞外活性物质，具有拮抗专化性，可以抑制不同种属的真菌和细菌，已在实际应用中取得了可喜的进展。假单胞杆菌属和伯克氏杆菌属在人工培养条件下产抗生素能力最强。生防假单胞杆菌能够产生一到多种抗生素，例如：2,4-二乙酰基藤黄酚(2,4-diacetylphloroglucinol, 2,4-DAPG)，吩嗪-1-羧酸(phenazine-1- carboxylic acid, PCA)，藤黄绿脓素(pyoluteorin)，硝吡咯菌素(pyrrolnitrin)和氰化物(HCN)，对疫霉菌、青枯病菌等均有一定的抗生活性4。在近二十年中，由于分子生物学手段应用于生防机制的研究，使微生物之间的拮抗作用成为生防机理研究中最清楚的部分。假单胞杆菌Hv37a产卵菌素(oomycin)A能力缺陷的突变株与野生菌株相比，防治棉花猝倒病的能力降低50%。同样，HCN、2,4-DAPG、吩嗪、硝吡咯以及荧光假单胞菌产生的吩嗪-1-羧酸可体外抑制小麦全蚀病菌Gaeumannomyces graminis var. tritici的生长。Thomshow等（2002）研究还表明基因直接参与抗生素的产生，通过采用高压液相色谱分析表明，在吩嗪产生菌定殖的小麦根部检测到了吩嗪，而在吩嗪合成基因缺失的突变体定殖的小麦根围没有检测到吩嗪，以上结论为荧光假单胞菌产生抗生素和它直接参与病害的防治提供了证据。为了说明假单胞杆菌产生的pyrrolnitrin在防治猝倒病中的作用，Homma等(1994)将纯化的pyrrolnitrin施于种子表面，研究抗生素对病原及病害的抑制情况，结果发现抗生素能够降低病害发生率3050%，这与使用菌剂包衣的防病效果相当。进一步为抗生素在生防菌防治病害中的重要性提供了直接的证据。Shanahan等人从一株荧光假单胞菌中提纯出2,4-DPAG，这种物质能保护甜菜免遭Pythiuim的侵染，Tn5突变的不产DAPG的突变体失去了抑制Pythiuim的能力。Keel等从另外一株荧光假单胞菌也分离到2,4-DPAG，它能抑制烟草黑根腐病和小麦全蚀病。Raajmakers等（1999）采用HPLC和透射电镜分析和观察了荧光假单胞菌在土壤中产生抗生素2，4-DPAG在抑制小麦全蚀病菌中的作用，结果证明2,4-DPAG是荧光菌防治全蚀病的关键因素。2 影响根际定殖的因子决定假单胞菌在寄主根际定殖能力的相关因子的研究报道并不多，这与根际的复杂程度和接种的生防细菌在根际的不稳定性相关。有研究结果表明，根分泌物中的多糖组分、根表的植物凝集素在定殖中起一定的作用。大豆根部分泌的凝集素对假单胞菌有一定的专一性，其参与细菌对根分泌物较多的位置表现凝集作用的趋性。生防作用、应用方法，定殖影响因素（二）芽孢杆菌芽孢杆菌属( Bacill us) 是一类好氧和兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。由于能够产生对热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品有很强抗性的芽孢,可忍受各种不良环境,如可以在pH 为23 的地方生存,也可以在温度高达80 甚至以上的地方生长,南极寒冷的冰雪中也能见到他们的踪迹,在自然界分布较为广泛。芽孢杆菌属与人类关系极为密切,是越来越引起人们重视和研究的一个重要的微生物类群。芽孢杆菌属的一个重要特征是好氧生长。能够产生芽孢是芽孢杆菌定属的首要特征。1 芽孢杆菌的应用生物肥料巨大芽孢杆菌等可降解土壤中难溶的含磷化合物,使之成为作物易吸收的可溶形态40 、50 年代,前苏联P. A 蒙金娜就曾经使用过以巨大芽孢杆菌为主的混合菌制剂来分解土壤中的有机磷化合物,并取得一定效果。自1958 年Hino 首次从日本土壤中分离到一株具有高固氮活性的芽孢杆菌固氮菌株后,土壤中新发现的芽孢杆菌固氮菌株越来越多,国际上承认的固氮能力较高的需氧芽孢杆菌为多粘芽孢杆菌的一个变种(亦称为固氮芽孢杆菌Bacillus azotofixans)。此外,也有一些巨大芽孢杆菌、球形芽孢杆菌的部分菌株有一定固氮能力的报道生物农药苏芸金芽孢杆菌( Bacillus thuringiensis) 最早在1905 年日本死于猝倒病的家蚕体内发现,并于1938 年在法国首次成为商品。苏芸金芽孢杆菌制剂已成为世界上产量最大的微生物杀虫剂。国内外有许多关于枯草芽孢杆菌对植物病原真菌的抑制作用及防治实验的报道。2 枯草芽孢杆菌的应用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn 是一种嗜温的好氧性产芽孢杆状细菌,革兰氏反应阳性(G+ ) ,因能产生多种抗菌素和酶而被广泛地应用于酶的生产、食品加工和贮存、纺织、造纸、医药及生物科学研究等领域。作为植物病原菌抗生体的B. subtilis 菌株,具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力并能在真菌性病原菌丝体表面繁衍定殖,有效抑制病菌生长。近年被引入植病生物防治领域,其在控制病害发生、促进植株生长,提高作物产量等方面显示出了广阔的应用前景(1) 在根部病害防治中的应用Sharma 和Jain(1978) 用从生姜根围分离到的B. subtilis 菌株防治由Fusarium f . sp. zingiberi 引起的生姜黄花病防治效果达19.4 %50 %,产量提高25 倍以上,其防病促生效果优于同等条件下的Aspergillus niger 和Memnoniella echinata 等真菌抗生体。Chang 和Kommedahl (1968) 用该类拮抗体菌剂浸泡玉米种子,不仅防止了幼苗枯萎病的发生、促进了幼苗生长、产量明显提高(其中感病品种的产量增幅大于抗病品种) ,还有效地控制了仓贮期玉米种腐,其效果与特效杀菌剂克菌丹(captan) 相同。杨佐忠(1990,1999) 用B. subtilis PRS5 菌株制剂分别浸泡杉木种子和雪松种子以防治苗木根腐病(R. solani) ,分别获得了高达87.4 %和99 %的防治效果,苗木高生长亦分别增加38.6 %和17.7 %以上,苗茎明显增粗;喷洒幼龄松苗有效地控制了猝倒病的发生;喷洒水稻秧苗或浸泡玉米种子使由R. solani引起的水稻纹枯病、玉米纹枯病(R. solani) 和玉米小斑病(Helminthosporium maydis) 分别减轻达50 %81 %、37.2 %和37.3 % ,产量得以大幅提高。(2) 在枝干病害防治中的应用Hall 等(1986) 发现槭树干部组织中的天然B. subtilis 分离物不仅能抑制轮枝霉菌(Verticillium sp. ) 引起的槭树枯萎病,还可沿木质部上移,存活期长达120天以上。Cubeta 等(1985) 发现用Bs1 菌株孢悬液处理大豆种子后,引起其植株茎部病害的茎点霉菌(Phomopsis sp.) 的存活率剧烈下降。向玉英(1984) 的研究表明,B. subtilis 等细菌抗生体对杨树溃疡病菌(Dothiorella gregaria)、腐烂病菌(Cytospora chrysosperma) 等的抑制效果优于木霉(Trichoderma spp.) 和曲霉(Aspergillus terrens) 等真菌抗生体,其中对腐烂病菌的有效抑制期为16 天左右。(3) 在叶、花部病害防治中的应用Baker 等(1983) 在接种大豆锈病菌(Uromyces phaseoli var. typical) 前,先用B. subtilis APPL21 液剂喷洒大豆植株,结果使该病菌的锈疱囊减少了95 %以上,叶片上的锈孢子难以正常产生芽管,部分孢子的细胞异常突起,萌发率大为下降。此后,他们又分别用APPL21 培养物和PPL23 的培养物滤液防治田间大豆锈病取得了良好效果。在Pinto 大豆品种上每周施洒3 次PPL23 滤液较之每周施一次代森锰锌(Mancozeb) 杀菌剂的防病效果更佳且能刺激植株生长。研究表明,B. subtilis 拮抗体能在生长期的杨树叶片上存活34 个月,显示出在防治杨树黑斑病(Massonina populicola) 和杨树炭疽病(Gloeosporium tremulae) 方面有较大的潜力. 曾大鹏等(1987)用B. subtilis 发酵液接种油茶花器(炭疽病菌的主要携带器官) 成功地减少了炭疽菌G. camelliae 对花器的侵染,显著降低了幼果的发病率,相对防效达40 %70 % ,提高油茶座果率7.1 % ,保果率增高11.9 %。(4) 在收获后果品病害防治中的应用20 世纪80 年代末期用B23 菌株悬液进行工厂化桃子生物防腐处理控制桃子腐烂的效果与防治该病的标准农药苯菌灵接近或相当。杨佐忠(1993) 用B. subtilis PRS5 菌株制剂防治由Penicillium italicum 和P. digitatum 引起的贮藏期柑橘腐烂病,在23 28 的恒高温条件下,分别使红桔、血橙的腐烂率下降76.19 %和50 %;朱天辉等(2000) 用B. subtilis BS23 菌株发酵液处理金花梨果腐病(Botrytis cinerea Pers. ) ,常温条件下的防腐效果达49.85 %62.5 %。为实现果品的无公害防腐保鲜,生产绿色食品奠定了良好的技术基础。二、放线菌放线菌(Actinomycetes)属于原核生物，广泛分布于自然界，除少数厌氧或兼性厌氧的寄生类群外，大多数是好气性的腐生菌。放线菌种类繁多，代谢功能各异，是一类有广泛实际用途的微生物资源。放线菌是抗生素等一系列生物活性物质的重要生产者。目前世界上报道的上万种抗生素中，70%以上是由放线菌产生的，且临床上使用的抗生素有三分之二来自放线菌。放线菌产生的抗生素在农作物病虫害生物防治方面也具有重要作用，如防治水稻纹枯病的井冈霉素(Validomycin)、防治蔬菜真菌性病害的武夷霉素(Wuyiencin)、防治作物细菌性病害的中生菌素等农用抗生素已在生产上发挥了重要作用。（一）生物学形态放线菌是真细菌的一个大类群，革兰氏阳性，在伯杰氏手册中属于厚壁菌门、放线菌纲。它们是具有多核的单细胞原核生物。比较原始的放线菌细胞是杆状分叉或只有基内菌丝(substrate hyphae)没有气生菌丝(aerial hyphae)。典型的放线菌除发达的基内菌丝外，还有发达的气生菌丝和孢子丝(图3-1)。放线菌产生的孢子从形成方式上有外生的和内生的两类。大多数放线菌的孢子是外生的，它们通常都是着生在气生菌丝的孢子丝上，也有的是在基内菌丝的顶端形成。孢子丝上形成的孢子为横隔分裂。放线菌的菌落形态随种类不同，一般有两种类型；一种类型的菌落为粘稠或粉浆状、粗糙或光滑，表面很少有气生菌丝覆盖。另一种类型的菌落是由产生基内菌丝体和气生菌丝体或只产生基内菌丝体的放线菌所形成的，这类菌落由于基内菌丝钻入基质内或紧贴培养基表面，比普通细菌的菌落更致密坚实，常为革质、崎岖、多皱。放线菌有两种繁殖方式。一种方式是通过形成无性孢子(分生孢子、孢囊孢子或游动孢子)的方法进行繁殖。当成熟的无性孢子散落在适宜的环境里吸收水分、膨胀、萌发、长出14根芽管，芽管进一步生长、分枝，形成菌丝体(图3-2)；另一种方式是菌丝体的无限伸长和分枝，或者通过菌丝断裂进行繁殖。（二）种类放线菌在土壤和根际中是仅次于细菌的第二大类微生物，土壤和根际放线菌的优势种群为链霉菌属(Streptomyces)，根据培养特征可分为12个类群。土壤和根际中常见的放线菌还有诺卡氏菌属(Nocardia )、小单胞菌属(Micromonospora)、放线菌属(Actinomyces)。1. 链霉菌属(Stretomyces) 在固体培养基上生长时，形成发达的基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝生长到一定时候分化产生孢子丝，孢子丝有直、波曲、螺旋形等各种形态。链霉菌的许多种类产生对人类有益的抗生素。如链霉素、红霉素、四环素等。2诺卡氏菌属（Nocardia）在固体培养基上生长时，只有基内菌丝，没有气生菌丝或只有很薄一层气生菌丝，靠菌丝断裂进行繁殖。该属能产生多种抗生素，如对结核分枝杆菌和麻疯分枝杆菌有特效的利福霉素。3小单孢菌属（Micromonospora）菌丝纤细，只形成基内菌丝，不形成气生菌丝，在基内菌丝上长出许多小分枝，顶端着生一个小孢子。此属也是产生抗生素较多的一个属，如庆大霉素就是由该属的绛红小单孢菌（M.purpurea）和棘孢小单孢菌(M.echinospora)产生的。（三）应用方式及其生防作用放线菌一般通过两种途径对靶标病菌发挥生防作用，它能够在寄主体外通过抗生作用、竞争作用、捕食和重寄生作用，降低病原菌的致病性、侵染效率以及接种体密度，导致病原菌群体密度以及致病性下降；放线菌也可以在寄主植物组织内，诱发其产生抗性或者产生抑菌物质，影响病原菌的繁殖、生长，最后导致靶标病菌死亡。1抗生菌的直接利用用放线菌制成的活细胞制剂，具有无毒、无残留、不伤害非靶标微生物、与环境兼容性好、防病持效期长等优点。世界上己有许多利用抗生菌防治土传病害的成功事例，如1953年从我国陕西省泾阳县的苜蓿根土中分离获得的细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)，用其制成的“5406”抗生菌推广的面积最大。它在生长过程中能分泌数种不同的抗生素，抑制黄萎病菌（Verticillium spp.）、枯萎病菌（Fusarium spp.）、立枯病菌（Rhizoctonia spp.）、猝倒病菌（Pythium spp.）等多种植物病原菌的生长，并能分泌激素促使植物细胞的分裂和伸长。通过拌种将“5406”抗生菌施于田间，具有防病、保苗和增产的效应。另一种放线菌的活体制剂Mycostop，是由芬兰的Kemira(1989)从泥煤中分离到的灰绿链霉菌(Streptomyces griseovidis)的孢子和菌丝制成的制剂。主要用来防治一些常见的土传病原菌，如腐霉菌、镰刀菌、疫霉菌（Phytophthora spp.）和丝核菌等。它还可用于控制温室中的观赏植物和蔬菜上的一些常见病害，如由链格孢(Alternaria spp.)、拟茎点霉(Phomopsis spp.)和灰葡萄孢(Botrytis spp.)等引起的病害。Mycostop主要是通过种子处理、土壤喷洒或灌药等措施处理作物，它在植物的根部定殖、生长和繁殖，从而阻止病原物的侵入，还可以产生激素促进寄主植物的生长，从而提高作物的产量，对植物没有任何毒性。2. 抗生素的利用抗生素(Antibiotics)是微生物产生的、在低浓度下对其它微生物的生长有抑制或杀灭作用的一类非酶类化学物质。它既不参与细胞结构，也不是细胞的贮存物质，对产生菌本身无害，但对敏感微生物有专性拮抗作用。放线菌是产生抗生素种类最多的一类微生物，人类从放线菌中分离到的抗生素达上万种，这些抗生素，已广泛应用于工业、农业和医学领域。在微生物农药中，农用抗生素的发展远比活体微生物农药发展快得多，它是随着医用抗生素的发展而发展起来的。至今不过40多年的历史。起初有些植病工作者利用医用链霉素和土霉素防治果树、蔬菜病害，收到一定效果，因而引起广泛注意。到20世纪50年代后期，日本因汞制剂停止生产使用，开始加强农用抗生素的研究。1958年，竹内等人筛选出灭瘟素（BlasticidinS）用于防治稻瘟病，取得显著效果。随后日本相继筛选出春日霉素（Kasugamycin）、多氧霉素（Polyoxins）、有效霉素（Validamycin），都有较大批量生产，曾一度代替化学农药在农业生产上大面积应用，产品远销许多国家。我国农用抗生素的研究 尹莘耘（1953）分离到5406菌株，对棉花黄萎病、枯萎病有一定防效，揭开了我国农用抗生素研究的序幕。张志雍（1959）、沈其益等（1963）用链霉素浸苗防治柑桔溃疡病，可保证无病苗木供应新区。中国科学院微生物研究所宋大康等相继筛选出灭瘟素（1959）、春雷霉素（1964）、多抗霉素（1967）产生菌，先后生产出抗生素，为我国农用抗生素事业作出过重大贡献。1983年，我国首次在常州召开生物防治座谈会，进一步促进了农用抗生素的发展。上海市农药研究所（1973）筛选出井冈霉素(Validomycin)产生菌，经多次诱变选出高产菌株，全国多家农药厂投产，每年使用面积达6.7×106ha以上，为我国农用抗生素开发积累了丰富的经验。近几年来，我国又筛选出多效霉素、农抗120、公主岭霉素、武夷霉素等。此外，中国科学院、上海植物生理研究所等还筛选出庆丰霉素（Qingfengmycin）（1970），湖北省农科院植保所筛选出农抗878和杀枯肽。如878抗生素在我国湖北、江苏和上海等地大面积使用来防治棉苗炭疽病。它具有防病保苗壮苗的功效，在生产上应用简便，对人畜无毒，使用安全，对棉苗的防效可高达60%80%。抗生素对微生物的抗菌机制可概括为如下4 种情况：阻碍菌体细胞壁的合成；影响菌体细胞膜的通透性；抑制核酸的合成；抑制菌体蛋白的合成。抗生素的应用方法有下列几种：对种子、秧苗传染的病害，可用抗生素浸种或苗床喷洒；对大田作物地上部病害，选择适当时期进行植株喷洒；在果木上使用，若治疗树干病部，一般是将抗生素制成油膏进行涂敷或涂刷，如用内疗素涂敷橡胶割面，防治橡胶条溃疡病；用放线酮涂刷树干防治白松孢锈病。防治叶部病害仍然是采用喷洒的方法。3酶及其代谢物的利用放线菌是一类比较特殊的微生物，它的生长比一般细菌和真菌慢，常在天然有机物分解的后期起重要作用，这些特殊的生态习性反映了它们的酶活性和代谢产物的作用。放线菌的代谢产物除了抗生素外，还有酶、有机酸、甾体化合物、维生素、核苷酸以及酶抑制剂等。植物病原高等真菌的细胞壁是以几丁质为骨架，以ß-1, 3-葡聚糖为主要填充物所组成的。处于生长过程中的菌丝尖端几丁质多呈裸露状态，易被水解酶所攻击而导致细胞破裂，生长受阻或者细胞死亡，阻止病害的发生发展。据报道，7%的放线菌都可以产生几丁质酶和ß-1, 3-葡聚糖酶等溶菌酶，因此对它的研究已经引起各国植病生防工作者的高度重视。放线菌的其它代谢产物在防治病害、促进作物的生长、提高作物产量等方面也起着重要的作用，正越来越多地被人们开发和应用。（四）放线菌作为生防制剂应用前景展望植物病害生物防治强调生态系统的良性循环和环境保护，由于其社会效益、生态效益、长远利益而愈来愈引起人们的重视，是符合我国农业生产持久稳定发展要求的长期策略。放线菌作为一种具有丰富资源的微生物类群，在植物病害生物防治中很有开发应用前景。但自然界有益放线菌的发现往往滞后于靶标病菌，有些种类对环境适应范围太窄、对农药的反应比靶标病原物更敏感、对靶标病菌的自然控制作用太缓慢，难以在植物病害可持续控制中发挥重要作用。这就需要我们通过物理、化学和分子生物学等方法改造野生放线菌，筛选具有对环境广适应性、对农药高抗性、高繁殖能力和对病害高控制能力的菌株。完成高产菌株选育和发酵工艺的研究，达到生物农药的技术指标。同时借助电子显微技术、生化技术、分子生物学技术，采取宏观与微观相结合，深入系统研究有益放线菌的生防机理和持久控制病害的能力，明确并试图克隆其功能基因。尽管生物农药在一个时期内还不能取代化学农药，但随着对使用化学农药附加越来越多的限制条件，现代生物技术的出现，尤其是基因工程技术的高速发展，为彻底改造野生放线菌提供了有利的工具，使我们又可能按照需要构建广谱、多功能的生物防治放线菌。可以预见，利用放线菌开发的生物农药将会具有更广阔的应用前景。三、生防真菌发现真菌及其代谢产物具有抑菌作用的现象始于十九世纪。人们相继证实了土壤中木霉菌、青霉菌、曲霉菌以及链霉菌等可以产生抗生物质，也认识到真菌对防治有害生物的重要性。近年来，有些真菌类生物杀菌剂已相继问世,并广泛应用于生产。生防真菌的种类繁多，目前常见的主要有木霉菌、毛壳菌、内生真菌、酵母菌、腐霉菌等。（一）木霉菌木霉属（Trichoderma spp.）属于真菌界、双核菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、从梗孢科,是土壤微生物区系的重要组成部分,其菌丝生长及孢子萌发能够适应较广的温湿度范围和pH范围,且腐生性强、生长和繁殖快,可迅速利用营养和占据空间。1 木霉菌的形态学木霉菌菌丛密集如毡；分生孢子梗从菌丝的侧枝长出，直立，小枝长对生，顶端不膨大，上生分生孢子团；分生孢子球形，浅色或者无色。2 木霉菌的分类Bisset等人（1991）把木霉属(Trichoderma)分为5个组,共31个种。国内外已经有多个商品化的木霉制剂问世，如美国的Topshield (哈茨木霉T-22) 和以色列的Trichodex (哈茨木霉T39)。截止到2004年，国内外已经登记的木霉菌制剂多达50种，其中主要包括哈茨木霉（Trichoderma harzianum），多孢木霉（T. polysporum），绿色木霉（T. viride）。3 木霉菌的生防特点（1）生长速度快,产孢量大。这种特性适于工业化生产的要求。现行的木霉菌剂以收获分生孢子为主,产孢量大是获得大量培养物的必需条件。生长速度快,能缩短生产周期,降低生产成本。（2）广谱性。木霉菌对多种重要植物病原真菌有作用,如腐霉菌、轮枝菌、镰刀菌、长孺孢菌、交链孢菌、丝核菌、葡萄孢菌等。据不完全统计,木霉菌至少对18个属的29种病原真菌表现拮抗活性。（3）广泛适应性。木霉菌的防治范围很广泛,主要是用于植物土传真菌病害的防治,有棉花枯黄萎病、猝倒病、立枯病、小麦全蚀病、纹枯病、各种蔬菜的苗期病害等。（4）在植物根际能大量定殖。木霉菌可为植株根际所促进,在根际能形成较大的群体,并能随根的生长而扩大其分布范围。（5）能作用于植物内部的病原菌。棉花枯萎病是维管束病害,侵入棉株后病菌处于一种受保护的体内环境,外部因素难以对其产生影响。木霉菌能靠寄生作用穿入病原真菌菌丝内部生长,有可能随侵入菌丝进入棉株内部,抑制棉花枯萎病菌的生长发育,达到防治病害的目的。（6）不受土壤抑菌作用的干扰。土壤抑菌作用是生防菌在大田失效的主要原因之一, 生防菌施入土壤后,或者被消灭,或者处于休眠状态,不能发挥其防病作用。要求木霉菌能克服或避开土壤抑菌作用,能迅速萌发增殖,形成有效群体。（7）分生孢子有强的耐干燥能力。从产品角度出发,耐干燥的分生孢子易于加工和贮存。从防病角度出发,有利于在干燥土壤中存活,一旦条件合适,即能快速发挥作用。（8）对作物生长有促进作用。作物生长状况的改善,有利于抗病性的提高,改善生防菌的防治效果。从生物学和生态学角度来看,从自然界获得这种菌株的可能性比较小,但是利用遗传工程技术对接近于上述理想化菌株的野生型进行改造,使之适合于不同的环境条件和作用对象,则是完全可行的,大量的研究报告已经证实了这一点。4 木霉菌的作用机制木霉菌的作用机制几乎包括了所有可能机制,并因此而受到广泛的关注,也是木霉菌用途广泛,效果突出的重要原因。据报道,木霉菌至少有如下几种作用机制:（1） 抗菌代谢产物的杀菌作用。抗菌代谢产物在目前的植病生防菌的筛选中是第一位的重要指标,产生抗菌代谢产物与否及其产量大小往往决定着一个生防菌株的命运。木霉菌在产生抗菌物质方面具有优势,就其种类而言,仅抗真菌的代谢产物至少在70种以上。多数种类产生的抗生物质不止一种,如哈茨木霉可产生12种,康氏木霉可产生9种,绿色木霉可产生10种,钩状木霉可产生7种,长枝木霉可产生3 种,多孢木霉可产生2种。这些抗生物质的化学性质各不相同,包括了戊酮、辛酮、类萜、多肽和氨基酸衍生物等几大类。（2）胞外酶溶菌作用。与拮抗木霉菌的生防作用有关的胞外酶主要是几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶。几丁质酶包括内切酶和外切酶两类,其中外切酶为N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶(N-acetylglucosaminidase)和几丁二糖酶(chitobiosidase)。这两类酶对植物病原真菌的细胞壁具有强烈的水解作用,从而抑制病原菌孢子萌发并引起菌丝以及孢子降解。（3）诱导植物抗性作用。植物在木聚糖酶作用下,具有明显的防御反应,K+、H+、Ca2+离子通道打开,合成乙烯以及积累PR蛋白等。（4）水解酶启动植物的防御反应。木霉菌产生几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶被认为在抗植物病原真菌中发挥重要作用。-1,3-葡聚糖酶使真菌细胞壁释放出-1,3-葡聚糖来源的诱导物(elicitor),启动植物的防御反应,导致植物产生和积累与抗病性有关的酚类化合物和木质素等。（5）保护酶增强植物抗病性。木霉菌不但对病原微生物具有拮抗作用，而且能够诱导植物产生抗病性。它通过引起过氧化物酶活性、同工酶等保护酶带图谱的动态变化来提高酶本身的活力,而且还能诱导产生新的同工酶谱带。（6）毒性蛋白作用。Lin等从一个绿色木霉菌株中分离到一种蛋白质tricholin，是核糖体钝化蛋白,能抑制Rhizoctonia solani生长与繁殖。研究表明,tricholin可导致1solani 的氨基酸吸收与蛋白质合成障碍,减少多聚核糖体的形成,从而减弱菌丝的生长。（7）重寄生作用。木霉菌丝可以沿寄主菌丝生长,或缠绕在寄主菌丝上生长,或穿入菌丝内部生长,从而导致寄主菌丝的死亡,木霉菌依靠寄主菌丝作为营养物质生长繁殖。目前已发现木霉菌至少可寄生18个属的29种植物病原真菌。（8）竞争作用。由于木霉菌大量繁殖,通过竞争与消解某些营养物质及产生毒性物质达到控制病害的目的。5 木霉菌的应用前景大量试验证实了木霉菌的生物防治效果,随着对木霉菌生防作用机制研究的日益深入,木霉菌可望在以下领域有更加深入的研究和广泛的应用。（1）生产高产高效菌株。从自然界中筛选优良菌株或利用基因工程技术和原生质体融合技术,构建高产高效木霉菌的生防菌株,防治植物病害。（2）代谢产物的应用。木霉菌不仅具有生防作用,而且可促进植物生长。木霉菌代谢产物拮抗病原菌和促植物生长的机制,利用生物工程技术生产双效生物制剂,代替化学药剂的使用。（3）在抗病育种上的应用。木霉菌作为外源基因的表达系统及作为新的基因工程受体菌正在引起广泛的兴趣。将木霉菌株代谢高效抗菌物质的基因导入农作物品种,以提高作物抗病能力, 减少化学农药的使用。（4）在环境保护上的应用。利用高效木霉菌株,转化或降解环境中的有害物和污染物,避免二次污染,减少环境治理费用。（二）毛壳菌毛壳菌（Chaetomium spp.）通常存在于土壤和有机肥中,是子囊菌纲的最大属中的一个,它可以有效降解纤维素和有机物,并对土壤中的其它微生物产生拮抗作用,因此,毛壳菌成为植物病原菌的生物防治菌并被广泛应用。通过探讨毛壳菌对植物病害的防治、防治的机理及其存在的问题,目的在于探讨生物防治菌的进一步开发利用的途径。世界上有毛壳菌300多个种,它可拮抗土壤中的某些微生物。现已发现有些毛壳属(球毛壳、角毛壳)可预防谷物秧苗的枯萎病、甘蔗猝倒病,降低由尖镰孢属引起的番茄枯萎病、黑星菌引起的苹果斑点病等的发病率,且对立枯病丝核菌、甘蓝格链孢属、拟茎点霉属、毛盘孢属、葡萄孢属以及交链孢属病原菌的生长有一定的抑制作用。毛壳菌是常见的霉腐菌,广泛分布于自然界的各种基物和发霉的含纤维素的日常用品上,包括植物残体、土壤、草食和杂食动物及鸟类和鼠类的粪便、种子、木材、皮革等。此属的大多数种都含有较强的纤维素酶,能有效降解纤维素和有机质。1 毛壳菌的分类地位毛壳菌属于子囊菌亚门、核菌纲、球壳目、黑孢壳科。其分类主要依据子囊壳的形状、子囊壳壁上生出的附属丝及其直径、子囊的形态、子囊孢子的形状和量度等。本属菌丝交织, 透明有隔。子囊壳表生,为球形、卵形或瓶形,顶端有一孔口。子囊壳壁的膜质呈透明或不透明,易破裂,表面着生各种形式的附属丝,通常分化为