肝癌相关抑癌基因及其研究现状.doc

The new research on tumor suppressor gene in hepatocellular carcinomaJI Yu-bin1,2,3, YANG Hai-fan1, YU Lei1,2,3, PANG lin-lin1, LI Hai-jiao1, LIU Guang-da1,2,3(1.Center of Research and Development on Life Sciences and Environmental Sciences, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2.Institute of Materia Medica and Postdoctoral Programme of Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China;3.Engineering Reseach Center of Natural Anticancer Drugs,Ministry of Education)Abstract: Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the leading causes of cancer-related death in the world. The carcinogenesis of HCC are multifactorial，multifunctional and multistage. But so far, there is not a particular gene to be a main tumor suppressor gene in HCC. Therefore, it is necessary to study on the new anti-oncogenes to explain pathogenesis of liver cancer and seek for the newly effective target to carry on liver cancer gene therapy. Now a summary is made, which is about the new research on tumor suppressor gene in hepatocellular carcinoma Keywords: HCC, anti-oncogenes, PTEN, KLF6, p16肝癌相关抑癌基因及其研究现状季宇彬1,2,3，杨海帆1作者简介：季宇彬(1956-),男,博士,博士后,教授,博士生导师, 研究方向：抗肿瘤药物研究*通讯作者 Tel:(0451)84844242 E-mail: yhf080163.com，于蕾1,2,3，庞琳琳1，李海娇1, 刘光达1（1.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076；2.哈尔滨商业大学药物研究所博士后科研工作站，哈尔滨 150076; 3.抗肿瘤天然药物教育部工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076）摘要：原发性肝细胞癌（HCC）是当今全球危及人类生命的恶性肿瘤之一，其发生、发展机制颇为复杂。抑癌基因治疗是众多基因疗法策略中的一种，它主要利用能够抑制细胞生长并具有潜在抑癌功能基因群，来阻断癌基因表达或恢复抑癌基因功能，达到抑制肿瘤发展或恢复正常表型的一种基因治疗方法。但到目前为止，尚没有一种基因成为大多数HCC的主要抑制基因，因此，有必要研究新的抑癌基因来阐明肝癌的发病机制，并寻求行之有效的新靶点进行肝癌基因治疗。本文仅就与原发性肝细胞性肝癌关系较为密切的三种抑癌基因作一综述。关键词：肝癌，抑癌基因，PTEN, KLF6, p161. PTENPTEN(Phosphate and tensin homolog deleted on chromosome 10)是1997年由3个研究小组发现的第1个具有磷酸酶活性的抑癌基因1。1.1 PTEN的结构与功能PTEN位于人类染色体l0q23.3，全长200kb，有9个外显子和8个内含子1，包括1209个核苷酸，编码一个含 403个氨基酸的蛋白，RNA长度为5.5kb和2.5kb，其产物的相对分子质量为56000, 多分布于细胞浆和细胞核内2。PTEN的结构可大体分为三个功能区，包括N端磷酸酶结构域，C端结构域和一个与脂质结合的C2区。研究表明PTEN具有两种磷酸酶活性。一种是脂质磷酸酶活性4，另一种是蛋白磷酸酶活性，现在已经发现PTEN能够使粘着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)和接头蛋白Shc去磷酸化，抑制细胞转移及浸润，同时抑制MAPK(促细胞分裂素激活的蛋白激酶)信号传导通路来抑制细胞分化5。1.2 PTEN的作用机制关于其主要作用机制和途径的讨论主要有以下三种：1.2.1 三磷脂酰肌醇途径（PIP3途径）：脂质PIP3是一种全新的磷酸酶作用的靶分子，位于细胞膜上，是细胞生长因子的信号转递分子。PTEN编码的蛋白具有脂质磷酸酶的活性，可使PIP3去磷酸化，阻止PI3K调控的生长因子信号转导通路，降低PIP3水平而使细胞停止于G1期，从而诱导肿瘤细胞凋亡6。Isabelle Opitz7等研究PTEN的表达缺失与间皮瘤的关系时，证明其与PI3K-AKT/PKB通路有关。Ömer H. Yilmaz, Sean J. Morrison8研究表明，抑制PTEN可以在PI3K/AKT通路对白血病肿瘤细胞和正常造血干细胞产生相反的影响。1.2.2 FAK途径局灶黏附激酶(focal adhesion kinase,FAK)几乎位于所有细胞的细胞膜，介导细胞与细胞外基质的黏附。整合素通过与细胞外基质作用而被活化，导致FAK酪氨酸磷酸化水平增高，并增加其磷酸激酶的活性，FAK再作用于丝氨酸、苏氨酸激酶(MAPK)和磷酸酶，最终导致某些关键因子磷酸化水平的改变及相关基因的表达。1.2.3丝裂原激活的蛋白激酶途径（MAPK途径）丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)可激活促细胞分裂素，介导有丝分裂信号向胞核传导，调控细胞生长。PTEN能抑制MAPK途径上游中的细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、RAS的活化以及Shc的磷酸化，从而对ERK/MAPK信号途径起负调节作用，而且PTEN基因还能抑制MAPK激酶的磷酸化，阻滞细胞生长周期于G1期，抑制肿瘤细胞生长。Sukmi Kang-Park9等研究表明，在HCC形成过程中，PTEN通过阻断PKC，MAPK以及MAPK激酶，最终降低IGF-II的表达。2.KLF6KLF6为近年发现的Kruppel-like家族中的成员，有可能成为有前途的HCC的抑制基因。2.1 KLF6结构与功能KLF6基因位于人类染色体10P15，基因全长6223bp，由4个外显子和3个内含子组成。其转录的mRNA全长约1600bp，其中3端非编码区较长(524bp)，约占全长的1/3，可能与mNRA的稳定性有关10。 KLF6通过GC盒启动子元件直接与DNA作用。野生型(WT)KLF6显著地减少了细胞增殖。而诱导的KLF6导致P21(WAFl/CIPI)表达的五倍增加11。2.2 KLF6的作用机制 最初研究表明，KLF6抑制细胞增殖是通过不依赖P53途径诱导P21WAF1表达而实现的。随着研究的深入，其它的抑癌机制己相继被发现。Ito等12发现虽然KLF6基因能显著抑制肺癌细胞株NC1-H1299及NC1-H2009细胞的生长，但细胞P21WAF1基因表达水平并无变化，进一步研究发现转染KLF6基因的NC1-H1299细胞发生了凋亡，凋亡程度与转染P53基因的NC1-H1299细胞相似，提示KLF6抑制细胞增殖可通过诱导凋亡途径实现。2.3 KLF6与肝癌 Kremer-Tal13等对40例肝细胞癌组织进行KLF6基因LOH或突变分析。研究结果显示39%肝癌组织存在KLF6基因LOH，KLF6基因突变率为15%，并且出现KLF6基因突变或LOH的癌肿大小明显大于无KLF6基因突变或LOH癌肿组织(9.09cm vs 4.09cm)，而癌旁组织未发现KLF6基因突变或LOH。王少平14等在27例肝癌组织中发现6例癌组织KLF6基因突变。Kremer等15以real-time RT-PCR检测肝细胞癌组织KLF6mNRA水平，结果显示，与正常肝组织相比约85%肝癌组织KLF6mRNA表达水平下降，其中2/3癌组织KLF6mRNA水平至少下降50%。我们以RT-PCR及Western blot同时检测肝细胞癌组织及对应的癌旁组织KLF6mRNA及蛋白质水平，初步结果表明部分癌组织KLF6mRNA或蛋白表达明显降低，因此KLF6表达水平的下降可能同样参与肝细胞癌的发病。Kremer-Tal的最新研究表明，KLF6的表达降低是肝癌形成的早期事件，在降低分化的同时，还会促进增殖16。3.p16p16，又称MTS1(mulitiple tumor suppresser gene l)，在细胞周期调控中起负性调节作用，防止细胞过度增殖，是一种与凋亡相关的肿瘤抑癌基因。3.1 p16的结构p16基因全长8.5kb，由2个内含子和3个外显子组成。氨基酸序列分析表明，成熟的p16分子为单链多肽，含有一个由148个氨基酸构成的开放阅读框架，具有4个回钩状重叠结构(ankyin repeat)的空间构型蛋白结构，该构型为p16蛋白活性所必需，主要由外显子2编码。P16蛋白N端含有与cyclin box具有同源性的序列17。3.2 p16的生物学功能与作用机制p16的功能主要是通过“细胞周期蛋白Dl(cyclinD1)-CDK4/CDK6-视网膜母细胞瘤基因蛋白(PRb)-E2F”途径完成的。当细胞进入G1期时，合成的cyclinD1与CDK4/CDK6结合形成具有催化活性的复合物，可使PRb磷酸化，后者促进转录因子E2F释放，允许重要的细胞调节因子转录，促进DNA的复制和细胞的分化，使细胞从Gl期进入S期。当E2F与次磷酸化的PRb结合失活，p16可与cyclinD1竞争，特异性地结合CDK4/CDK6或与cyclinD1-CDK4/CDK6复合物结合，直接抑制CDK4/CDK6的活性，阻止细胞从G1S期的转变和DNA合成的启动18。3.3 p16与肝癌大量研究显示，HCC组织中存在p16基因的异常及p16蛋白的表达缺失，p16在HCC的致病机制中发挥重要作用。p16基因的异常包括基因突变、杂合性缺失和纯合性缺失、基因的高甲基化。3.3.1 p16基因突变与HCCp16基因在HCC组织中的突变主要发生于外显子2中，其方式可为无义突变、错义突变、移码突变等。在HCC组织中p16基因的突变不常见，而且其发生率低于肝肿瘤细胞系。Chen等l9先用聚合酶链反应-单链构象多态性分析法(PCR-SSCP)筛选HCC组织中有p16基因突变的病例，然后对阳性病例进行测序，结果30例HCC组织中有1例p16外显子2的第61位密码子发生了G-T颠换，即同义突变(GAG.-TAG)。3.3.2 p16基因缺失与HCC纯合性缺失和杂合性缺失是抑癌基因失活的重要形式。Lee等20用7个微卫星标志物对9例HCC组织中染色体9p的杂合性缺失进行分析，发现33%(3/9)病例在肿瘤细胞的9p21存在杂合性缺失。一般认为，HCC组织中p16基因纯合性缺失的发生率高于杂合性缺失。Huang等2l检测了25例HCC标本，其中有2例纯合性缺失，1例杂合性缺失。Jin等22用RT-PCR检测了20例HCC组织，结果发现，p16mRNA的缺失率为55%，而且在染色体9p21编码的3个周期调节蛋白中，p16蛋白失活的频率最高。3.3.3 p16甲基化与HCCDNA胞嘧啶C-5位甲基转移酶，在p16基因的甲基化过程中发挥重要作用。目前认为，p16基因的高度甲基化在HCC致病机制中的作用远大于p16基因的突变、杂合性缺失及纯合性缺失。Pulling等23通过动物实验发现，肝癌组织中p16基因的甲基化率高达45%，这些基因的甲基化广泛存在于P16的5端非翻译区及外显子1区，提示由p16蛋白缺失引发的肝细胞异常增殖与p16基因甲基化后的转录缺陷相关。更值得注意的是，转录缺失的程度又与p16基因的甲基化程度有关。Matsuda等24发现，无p16基因表达及p16基因微弱表达的人肝癌组织中，CpG岛的甲基化率分别为60%80%及25%以下，p16基因正常表达者未发现DNA的甲基化，说明了肝癌组织中p16基因CpG岛的甲基化是P16失活的主要原因。4. 展望目前发现的肝癌抑癌基因有p53基因、p21基因、p27基因、p73基因、Rb基因、APL基因、FHIT基因、sprouty基因、MIA2基因等数十种，我们相信，随着研究的深人，抑癌基因载体的不断改进，和抑癌基因治疗给药途径的不断优化，以及新的抑癌基因治疗方案的不断出现，高效、安全的肝癌抑癌基因治疗将广泛应用于临床。References：1 Tian XX, Wu HQ. 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