体外分析的数据处理-检验核医学.ppt

体外分析的数据处理,数据处理基本步骤,数据处理是将实验测得的未知样品的直接结果换算成剂量，每次实验均需绘制标准曲线（剂量反应曲线），从中查出待测样品剂量。 1、绘图法（有人为误差） 2、数学模型拟合法,第一节 RIA、IRMA剂量反应曲线的建立,一、RIA剂量反应曲线 二、IRMA剂量反应曲线,一、RIA剂量反应曲线,反应动力学模式： *Ag+Ag+Ab (*Ag-Ab)+(Ag-Ab) 其中：Ab限量 （*Ag+Ag）抗原决定簇 Ab结合位点 对于Ab， *Ag和Ag不可辨别，与Ab结合机 率一致 如果：固定*Ag量， Ag则（*Ag-Ab）， Ag则（*Ag-Ab）； Ag浓度与（*Ag-Ab）放射性计数呈反向关系,RIA剂量反应曲线,RIA-Kit有一组具有梯度，已知为标准浓度的Ag标准品，以此为横坐标，以与之相对应的（*Ag-Ab）放射性计数为纵坐标，可建立反映Ag浓度与（*Ag-Ab）计数的反向变化规律曲线RIA剂量反应曲线。 待测物的Ag浓度可根据其对应的（*Ag-Ab）计数，在曲线中查得。,常用专业名词,T（Total）管计数：每一试管投入的*Ag的 放射性计数。 B（Bound）管计数：（*Ag-Ab）的计数也 称结合计数 Bo管计数：当Ag=0浓度时的（*Ag-Ab） 计数，为最大结合计数 F（Free）计数：游离的*Ag的放射性计数， F=T-B,RIA剂量反应曲线反应坐标（纵坐标）表达方式,B-(*Ag-Ab)计数 F/B或B/F 结合计数与游离计数之比,B,T,=,(*Ag-Ab)计数,每管总计数,1,B,B0,=,(*Ag-Ab)计数,“0”管(*Ag-Ab)计数,1,二、IRMA剂量反应曲线,反应动力学基本模式 -Ab(m)+Ag -Ab(m)·Ag+*Ab（过量） -Ab(m)·Ag·*Ab+*Ab（余） 试中：Ag标准品或待测样品 如果 Ag -Ab(m)·Ag·*Ab，两者呈正向关系,IRMA剂量反应曲线,以Ag浓度为横坐标，其对应的-Ab(m)·Ag·*Ab计数为纵坐标（反应坐标），可建立两者的正向变化规律曲线IRMA剂量反应曲线。 待测物Ag的浓度，可根据其对应的-Ab(m)·Ag+*Ab计数在曲线中查得。 B（Bound）计数：- Ab(m)·Ag·*Ab放射性计数 Bmax计数：当标准品Ag的浓度为最大的点,对应的 - Ab(m)·Ag·*Ab计数,IRMA剂量反应曲线纵坐标（反应坐标）表达方式,B- -Ab(m)·Ag·*Ab放射性计数 F/B或B/F（结合计数与游离计数之比）,B,Bmax,=,-Ab(m)·Ag·*Ab放射性计数,标准品max -Ab(m).Ag.*Ab计数,1,第二节 RIA、IRMA剂量反应 曲线处理的常用模式,函数表达式 y=f(x) 模拟曲线规律,常用方法有： 1、线性内插 2、坐标变换法（直线化法） 3、多项式拟合 4、样条函数拟合 5、四、五参数logistic模型 6、单位点质量作用定律模型,最小二乘法,一、线性内插,式中：Xa未知样品上一点标准品浓度（已知） Xb未知样品下一点标准品浓度（已知） ya标准品Xa对应的反应参数（B计数 或结合率测量数） yb标准品Xb对应的反应参数（B计数或结合 率测量数） y未知样品对应的反应参数（B计数或结合 率测量数）,ya-y,ya-yb,=,X-Xa,Xb-xa,(对应边成比例),优点：计算简便 缺点：误差不均匀，尤其在直线的两侧误差不对称，误差较大。,二、坐标变换法（直线化法）,常用loglogit方式 纵坐标变换y'=Lny/(1-y) (y为结合率B/B0) 横坐标变换X'=LnX（X标准品Ag浓度） 数学模型：Lny/(1-y)=a+bLnX,y与Lny/(1-y)的比较,y=0.5 Lny/(1-y)=0 y Lny/(1-y) y Lny/(1-y) 0.9 2.197 0.1 -2.197 0.8 1.386 0.2 -1.386 0.7 0.847 0.3 -0.847 0.6 0.405 0.4 -0.405,优点：可使误差的不均匀性通过加权补偿，且可将坏点去除。 缺点：零剂量点丢失，灵敏度降低。不适用于顺序加样法。如有坏点，整条曲线会偏离。,三、多项式拟合,y=a0+a1x+a2x2+a3x3+anx RIA和IRMA常用： y=a0+a1x+a2x2+a3x3 y结合计数或结合率或 y=a0+a1x1/2+a2x+a3x3/2 x标准品Ag浓度,优点：无论曲线好坏均可拟合。 缺点：仅能在某一区域模拟剂量反应曲线，普遍适用性差。曲线容易出现震荡，尤其是高剂量端，造成测量值偏小。,四、样条函数拟合,实为曲线内插，分段用三项函数拟合，然后进行平滑修正。 模式：y=ai+bi(x-xi)+ci(x-xi)2+di(x-xi)3 y反应参数（计数或结合率） x标准品Ag浓度,五、四、五参数logistic模型,由log-logit转化而来 g为不对称因子，如果g=1，上述模型成为四叁数 式中： y为反应参数（B计数或B/B0，IRMA为B计数或B/Bmax）； a为曲线上渐近线估值，d为曲线下渐近线估值； b为曲线斜率；c为最大结合一半时对应的剂量,模型,Y=,a-d,1-(x/c)bg,+d,优点：不事先扣除NSB，而是通过计算机拟合扣除，避免因NSB不准而造成的误差。目前最为常用。,六、单位点质量作用定律模型,反应参数R=F/B 四参数适用于RIA 模型：b(c+p*+x)+qR2+c(b-1)+q-p*-xR-C=0 式中：x为标准品Ag浓度 拟合参数：p*Ag0 qAb0 C 抗体效价 b为F·*Ag与NSB的比值 三参数适用于IRMA 模型：b(c+q)+DR2+c(b-1)+D-qR-C=0 拟合参数：b、c、q 式中：D为标准品Ag浓度,第三节 拟合曲线的评价,一、常用评价指标,残差 Q=(yi-y) 相关指数 R2=1- 0.990 拟合百分比偏差 DEV%=(/Xi)×100% 10%,Q,(yi-y)2,二、拟合应注意,只是对由标准品及其相应的反应参数决定的曲线段进行拟合，该范围 内曲线应保证单调性，决不能外延。 剔除坏点，应注意头尾两点剔除应慎重 标准品点数应至少比拟合参数数目多2个 曲线拟合，作用是为了规范，防止随意性，不可能将坏的结果变好，如模型选择不当，只能把好的结果变坏，只有把好实验质量，才能提高实验结果的精度。,三、标准曲线应符合的条件,B1/B085%，Bn/B03,四、标准曲线的质控参数,B0%：3070% ，50%最佳 NSB/T0.99 拟合百分比偏差（DEV%）： |DEV%|10%,第四节 肝炎筛选的处理,一、对照组要求,1、计算阴性和阳性 对照的平均计数,Nx= Ni（阴性对照样品n5） Px= Pi（阳性对照样品n3）,1,n,1,n,2、控制对照组离散范围, Ni1.5Nx 或Ni1.5Px 或Pi0.5Pi 剔除，重新计算Px,3、要求：Px与Nx相差 410倍,二、临界值判定,1、常用判定公式 s/N x2.1 或 2、不确定区范围和Nx计数水平有关 Nx 不确定区（S/Nx） 50 1.06-3.3 100 1.48-2.78 300 1.81-2.41 500 1.91-2.32 有的试剂盒确定为2.1±0.2为不确定区。 在不确定区范围内的S/Nx的样品，应重新再做一遍，阳性结果仍然重复为阳性结果者判为阳性，否则一律判为阴性。,s,N x +P x,0.5,第五节 RBA的数据处理 （单位点）,一、单点法RBA的数据处理,例：实验室进行外周血WBC的GCR分析，测得TB为4500cpm，NSB为2500cpm，3H-Dex的SA为1.85×1012Bq/mmol，蛋白量为1mg，液闪的Eff=30% SB=TB-NSB=4500-2500=2000cpm 2000/（0.3×60×1.85×1012×1）=60fmol/mg,1mol=6.02×1023分子 60fmol/mg= 60×10-15×6.02×1023=3.6×1010受体/mg蛋白 若：WBC细胞数为7.5×106个，则 RT=3.6×1010/ 7.5×106=4800受体/细胞,二、多点法（以Scatchard为例）,例： 实验室做外周血WBC的GCR多点分析，3H-Dex的SA为38.0Ci/mmol，放化纯为99%，配成工作浓度10uCi/ml.,1、加样程序,2、测量结果,3、建立NSB的回归方程,以NSB管的cpm对3H-Dex的体积数（10、20、25、3040、50）建立回归方程，得到： Y=52.5456X+45.7007（r=0.9997） 将未做的NSB管对应的3H-Dex体积（20、40）代入方程，得到NSB各管值。 （10、571）；（20、1097）；（25、1359）；（30、1622）；（40、2148）；（50、2673）,4、计算B、F和B/F,5、换算B相对应的3H-Dex 物质量,比放= SA为38.0Ci/mmol，放化纯为99%，Eff=42% 1、38Ci/mmol=38uCi/nmol=1.406×106Bq/nmol 2、1nmol=1.406×106Bq÷0.99=1.4202×106Bq 3、1cpm=1/(0.42×60)=0.03968Bq =0.03968/(1. 4202×106Bq)=0.0282fmol,换算B对应的fmol数,1215cpm-34.26（fmol） 1702cpm-48.00 （fmol） 1963cpm-55.36 （fmol） 2005cpm-56.54（fmol） 2087cpm-58.85 （fmol） 2067cpm-58.30 （fmol） 以B对应的fmol数为横坐标，B/F为纵坐标进行Scatchard作图,6、Scatchard作图,7、计算RT和KD,y=0时，对应的为RT 即 RT=0.01542/0.0001972=78.195fmol 如果细胞数为7.5×106个，则 RT=6276个受体/细胞 截距=RT/KD，故KD=RT/截距 截距为X=0时的y值，故： KD=RT/0.01542=5.07nM,思考题,1、T、B、F、B0；B/T、B/B0、F/B、含意。 2、常用曲线拟合有哪几种方式？ 3、曲线拟合评价指标有哪些？ 4、如何进行单位点RBA（单点法）的数据处理？,