《核酸化学》PPT课件.ppt

第四章 核酸化学,Nucleic Acid chemistry,第一节 概述 第二节 核酸的化学组成 第三节 核酸的分子结构 第四节 核酸的性质 第五节 核酸的研究方法,本章内容,第一节 概 述,核酸（nucleic acidNA）是一类重要的生物大分子，担负着生命信息的储存与传递。 核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域，是基因工程操作的核心分子。,1868 F. Miescher从脓细胞的细胞核中分离出了一 种含磷酸的有机物，当时称为核素（nuclein）,后称为核酸（nucleic acid）。 1944 Avery 等通过肺炎球菌转化试验证明DNA是遗传物质。 1952 Hershey, Chase-噬菌体标记实验。 1953 Watson和Crick提出DNA结构的双螺旋模型。 1958 Crick提出遗传信息传递的中心法则。 1973 Boyer，Cohen-DNA Cloning(克隆）。 1976 DNA Sequencing(序列分析）。 1990 Human Genome Project（人类基因组计划）。,一、核酸的研究历史,光滑型细胞（有毒）,粗糙型细胞（无毒）,破碎细胞,DNAase降解后的DNA,粗糙型细胞接受光滑型DNA,只有粗糙型,大多数仍为粗糙型,少数光滑型细胞被转化,S,S,R,R,R,+,DNA,1944年Avery细菌转化实验,肺炎球菌（pneumococcus）,1928年细菌学家Griffith 细菌毒性实验,噬菌体感染实验,1952年美国Hershey 噬菌体感染实验,真核生物 原核生物 细胞核（98%） 拟核 线粒体mDNA （少量） 质粒DNA（plasmid） 叶绿体ctDNA （少量）等 病毒DNA 细胞质（90%） 细胞质 核仁（少量） 病毒RNA,二、核酸的种类和分布,DNA 脱氧核糖核酸,RNA 核糖核酸,注：生物细胞都含有DNA 和 RNA； 病毒中只含 DNA 或 只含 RNA。,第二节 核酸的化学组成,核酸是由几十个甚至几千万个核苷酸聚合而成的具有一定空间结构的生物大分子。,基本元素：C、H、O、N、P ； 其中P 的含量比较稳定，占9%-10%，通过测定P 的含量来推算核酸的含量（定磷法）。,一、戊糖,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。,二、碱基,1. 嘌呤（Purine）,2. 嘧啶（Pyrimidine）,核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。,二氢尿嘧啶 （DHU）,修饰碱基的简写符号,( 为1时可以不写 ),三、核苷（nucleoside）,核苷：戊糖+碱基 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键 核苷中戊糖与碱基的连接方式：,修饰核苷/稀有核苷,修饰核苷包括三种情况:,（1）由修饰碱基和糖组成的核苷,（2）由非修饰碱基和2'-O-甲基核糖组成的核苷,（3）由碱基与糖连接方式特殊的核苷,（1）,（2）,二氢尿嘧啶核苷,(Am),（3）,(),取代基用下列小写英文字母表示 :,例：,四、核苷酸（nucleotide） 核苷酸： 核苷+磷酸 戊糖+碱基+磷酸,H,五、游离核苷酸及其衍生物的形式,1. 继续磷酸化,2.环化磷酸化,cAMP,cGMP,3.辅酶 NAD、NADP、FAD、HSCoA,FAD,NAD、NADP,HSCoA,4. GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白 生物合成和多糖生物合成的活性糖 基供体。,第三节 核酸的分子结构,一、DNA的结构 一级结构: DNA核苷酸链中脱氧核苷 酸的组成和排列顺序。 二级结构：DNA的两条多聚链间通过 氢键形成的双螺旋结构。 三级结构：DNA双链进一步折叠卷曲 形成的构象。,（一）DNA的一级结构,由dAMP、dGMP、 dCMP、 dTMP核苷酸单体通 过3,5-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。,结构式,5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羟基端（常用3 -OH表示） 核苷酸链具有方向性，当表示一个核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是35。,DNA的一级结构也可指DNA分子中碱基的顺序。 DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形 式。生物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种 核苷酸千变万化的不同排列组合之中。,（二）DNA的二级结构,Watson 和 Crick 于1953年提出了DNA 双螺旋结构模型，说明了DNA 的二级结构。（即B型DNA）,（1）Chargaff定则 （1950s,E. Chargaff发现）,DNA碱基组成符合： A=T；G=C； A+G=T+C。 不对称比率：A+T/G+C； 物种不同，DNA碱基组成不同； 物种亲缘愈接近，碱基组成也愈接近，该比 率越相近似。 .具有种的特异性，没有器官和组织的特异性，年龄、营养状况、环境的改变不影响DNA的碱基组成。,1提出DNA双螺旋结构模型的根据,（2）x-光衍射分析,2DNA双螺旋结构模型（double-helical structure）,1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构。,DNA双螺旋结构模型要点（1）,螺旋中的两条链反向平行，即其中一条链的方向为53，而另一条链的方向为35，两条链共同围绕一个假想的中心轴呈右手双螺旋结构。,DNA双螺旋结构模型要点（2）,疏水的碱基位于双螺旋的内侧，亲水的磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基平面与螺旋轴垂直，脱氧核糖平面与中心轴平行。 由于几何形状的限制，碱基对只能由嘌呤和嘧啶配对，即A与T，G与C。这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键， G与C之间形成三个氢键。,DNA双螺旋结构模型要点（3）,由于碱基对排列的方向性，使得碱基对占据的空间是不对称的，因此，在双螺旋的表面形成大小两个凹槽，分别称为大沟和小沟，二者交替出现。,DNA双螺旋结构模型要点（4）,双螺旋横截面的直径约为2 nm，相邻两个碱基平面之间的距离（轴距）为0.34 nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺距（即螺旋旋转一圈）的高度）为3.4 nm。,DNA双螺旋结构模型要点（5）,两条链借碱基之间的氢键和碱基堆积力（即碱基之间的范德华力）牢固的连接起来，维持DNA双螺旋的三维结构。 两条链是碱基互补关系。,3. DNA的双螺旋结构稳定因素, 氢键 碱基堆积力 磷酸基上负电荷被胞内组蛋白或正离子中和 碱基处于疏水环境中,4. DNA的双螺旋结构的意义,该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原则，这是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。该模型的提出是上个世纪生命科学的重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石。,DNA双螺旋构象的类型,（三）DNA的三级结构-超螺旋,1）超螺旋是指双螺旋进 一步扭曲或再螺旋的构 象。 2）正超螺旋（变紧，过 旋）和负超螺旋（变松， 欠旋）。 3）人类46条染色体的 DNA总长可达1.7m，经过 螺旋化压缩，实际总长只 有200nm。,负超螺旋,核小体盘绕及染色质示意图,DNA的存在形式-核小体,真核生物中DNA双螺旋沿着组蛋白八聚体核心的短轴绕1.75圈，形成左手超螺旋，称核小体。 染色质的基本结构单位是核小体。 串珠状结构进一步卷曲形成螺线管，后者再进一步卷曲形成超螺旋管，形成染色单体。,基因和基因组,基因即一段有功能的DNA片段，生物细胞中DNA分子的最小功能单位（交换单位）。 一个细胞或生物体所含的全套基因称基因组。,二、RNA的分子结构,（一） RNA的分类及特点 （二） RNA分子的结构特点,（一）RNA的特点及分类,结构特点： 1. 碱基组成：A、G、C、U （AU/GC）； 2. 稀有碱基较多，稳定性较差，易水解； 3. 多为单链结构，少数局部形成螺旋（发夹结构）； 4. 分子较小。 分类： 1. 信使RNA（ mRNA） 2. 转运RNA （ tRNA） 3. 核糖体RNA （r RNA）,Messenger RNA,约占总RNA的3%-5%，含量最少，种类最多。 成熟mRNA不含内含子，hnRNA含有。 mRNA从DNA转录遗传信息，并作为蛋白质合成的模板，决定蛋白质的氨基酸顺序。,Ribosome RNA,约占全部RNA的80%，含量最多。 与多种蛋白质结合成核糖体，后者是合成蛋白质的场所。,Transfer RNA,约占总RNA的10-15%，分子最小。 它在蛋白质生物合成中起翻译mRNA信息，并将相应的氨基酸转运到核糖体，参与蛋白质体的合成。 已知每一个氨基酸至少有一个相应的tRNA。,（二）RNA分子的结构特点,tRNA 的结构,二级结构特征： 单链 三叶草叶形 四臂四环,三级结构 特征： 在二级结构基础上 进一步折叠扭曲形成倒 L型,酵母tRNA Ala 的二级结构,DHU环,2） rRNA的分子结构,特征： 单链，螺旋化程度较tRNA低 与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能,5SRNA的二级结构,3）mRNA的分子结构,在转录一章讲授,第四节 核酸的性质,一、一般物理性质 二、核酸的水解 三、两性解离 四、紫外吸收性质 五、稳定性 六、变性 七、复性与杂交,一、一般物理性质,1. DNA白色纤维状固体，RNA白色粉末状固 体，都微溶于水，不溶于乙醇，因此常用乙醇来 沉淀DNA ； DNA溶液黏度大于RNA 。 2. DNA难溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于 12 mol/L的NaCl溶液，RNA则相反，可据此 分离二者。 3. 加热条件下， D核糖浓盐酸苔黑酚 绿色 D2脱氧核糖酸二苯胺 蓝紫色,二、核酸的水解,核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。 DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。室温条件下，DNA在碱中变性，但不水解，RNA水解。 在细胞内核酸分子受DNA酶作用。,三、两性解离,核酸含酸性的磷酸基团，又含弱碱性的碱基，为两性电解质，可发生两性解离； 核酸相当于多元酸，pH大于4时，呈阴离子状态； 等电点,四、紫外吸收,在核酸分子中嘌呤碱和嘧啶碱都含有共轭双键体系，在260 nm有吸收； 可以作为区别蛋白质和对核酸及其组份定性和定量测定的依据，进行核酸纯度鉴定，也可作为核酸变性和复性的指标。,DNA的紫外吸收光谱,天然DNA 变性DNA 核苷酸总吸收值,1 2 3,根据A260/A280的比值判断核酸样品的纯度,纯DNA：A260/A280=1.8 纯RNA：A260/A280=2.0,（若样品中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低）,纯的核酸样品可根据260nm的光吸收值算出其含量,若260nm光吸收值为1相当于50g/ml双螺旋DNA,或相当于40g/ml单链DNA或RNA,或相当于20g/ml寡核苷酸。,五、DNA的稳定性,1.DNA的溶液呈粘稠状，但实际上DNA 的双螺旋结构僵直而有刚性，易断成 碎片，这也是目前难以获得完整大分 子DNA的原因。 2.溶液状态的DNA易受DNA酶作用而降 解，抽干水分的DNA性质十分稳定。,六、DNA的变性,1. 概念 2. 变性条件 3. 变性的特征,1. 概念,是指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂，变成单链结构的过程。,2.DNA的变性的条件,能够引起核酸变性的因素有： 1）温度升高； 2）酸碱度改变、 pH（11.3或5.0）； 3）有机溶剂如甲醛和尿素、甲酰胺等； 4）低离子强度。,3.DNA变性的特征,变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。 变性改变了DNA的二级结构。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变。 DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。 DNA解链温度 紫外吸收值明显增加，即增色效应。 粘度降低，沉降系数增加。,DNA解链温度（熔点，Tm ）,当50% 的DNA变性时的温度称为该DNA的解链温度，即增色效应达到一半时的温度；一般DNA的Tm值在70-85C之间。 均一DNA（如病毒）的Tm值范围较小。 分子中G和C的含量越高，越不易变性，Tm值越高。可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44 Tm值随溶液盐浓度增加而增大， Tm值较低，易变性，不易保存。,溶解曲线与Tm。,。,影响Tm值的因素, DNA的均一性, DNA中G-C对的含量,经验式: (G-C)%=(Tm-69.3)×2.44, 盐离子强度,增色效应与减色效应,天然DNA分子在热变性条件下，双螺 旋结构破坏，碱基暴露，在紫外光260nm 波长处的吸收度明显增加，此现象称为 增色效应。 变性DNA分子复性形成双螺旋结构时 其紫外吸收降低的现象称为减色效应。,七、DNA的复性,概念 复性的条件 3. 影响复性的因素 4. 复性动力学 5. 分子杂交,1. 概念,1.变性DNA在适当的条件下，两条彼此分 开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构， 其物理性质和生物活性随之恢复，这一过 程称为复性； 2.对于热变性的DNA，在缓慢冷却的条件 下可重新结合恢复双螺旋结构，称为退 火。 3.DNA复性后，一系列性质将得到恢复， 但是生物活性一般只能得到部分的恢复。,DNA的复性图示,2.DNA的复性条件,1.将热变性的DNA骤然冷却至低温 时，DNA不可能复性。即淬火。 2.将变性的DNA缓慢冷却时，可以复 性。退火温度Tm25 3.分子量越大复性越难。浓度越大， 复性越容易。此外，DNA的复性需要 一定的盐浓度，也与它本身的组成和 结构有关。,复性 也称退火,3. 影响复性的因素, 样品的性质, DNA的浓度, DNA片段的大小, 温度, 离子强度,4.复性动力学,DNA的复性过程是一种双分子反应,S：single strand DNA,D：double strand DNA,5.分子杂交,1.在变性的DNA溶液中加入外源DNA单链分子或 RNA单链分子（与原DNA具有同源性），去掉变 性条件后复性形成双螺旋结构的过程。 2.这样形成的新分子称为杂交DNA分子。 3.利用核酸杂交可检测特定的核苷酸片段或研 究同源性等。,分子杂交,探针：用于杂交的异源DNA或RNA序列，其核苷酸序列是人工特定的、已知的，经放射性标记的一条链。,核酸的变性、复性和杂交,分子杂交的种类,Southern Blot：DNA-DNA杂交 Northern Blot：DNA-RNA杂交 Western Blot：抗原-抗体进行杂交 原位杂交：活体组织上进行杂交，显出荧光,Southern印迹法,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,转移至硝酸纤维素膜上,与放射性标记DNA探针杂交,放射自显影,带有DNA片段的凝胶,凝胶,滤膜,用缓冲液转移DNA,吸附有DNA片段的膜,第五节 核酸的研究方法,一、核酸的分离、提取通则,为了得到完整的大分子核酸，一般要注意3点 ： 1保持低温（0º4）。 2防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌。 3防止核酸酶的作用。,抑制DNase：,可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂 十二烷基硫酸钠（SDS）；或加蛋白变性剂。,抑制RNase：,（1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用 具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethyl pyrocarbonate, DEPC）处理。,（2）加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。,（3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的抑制剂。,二、大分子DNA的提取,1材料的选择,2细胞破碎,3DNA-蛋白质（DNP）的提取,真核细胞DNA与蛋白质结合成核蛋白（DNP），RNA与蛋白质结合成RNP，而且DNP和RNP常常混在一起。利用DNP和RNP在不同浓度NaCl中溶解度的不同来分离DNP和RNP。,可用1mol/LNaCl溶液提取DNP。,相 对 溶 解 度,NaCl（mol/L）,DNP在NaCl中的溶解度,4去蛋白质,（1）SDS,（2）苯酚法,（3）氯仿法,（4）酚:氯仿:异戊醇25:24:1,5沉淀DNA,6去杂质,（1）去RNA,（2）去多糖,7进一步纯化,生物材料,DNP（RNP）,DNP,纤维状DNA,较纯DNA,纯DNA,*原核生物的DNA是裸露的，与蛋白质结合不多，分离纯化要简单些。,破细胞,1.0mol/L NaCl*,去蛋白质,酒精沉淀,去RNA,柱层析，电泳,密度梯度离心,去多糖,三、RNA的提取,1不同种类RNA的提取,2大分子RNA的提取,（1）酚提取,（2）酚-氯仿-SDS法,3mRNA的提取,四、核酸纯度鉴定,1.A260/A280,2.电泳,五、核酸含量的测定,1.定磷法,2.定糖法,3.紫外吸收法,本章重点:,1. 核酸的化学本质、结构和性质 2. DNA双螺旋结构的基本特征,