无病毒植物的培养.ppt

,第四章 无病毒植物的培养,教学目的和要求,(1）了解植物病毒的危害和培养无病毒植物的意义。 （2）理解和掌握脱除植物病毒的原理及方法。 （3）了解分离茎尖的培养情况。 （4）一般掌握无毒苗木的鉴定方法。 （5）一般掌握脱毒苗木的保存和利用方法。,第一节 植物病毒的危害和培养无病毒植物的意义,病毒之所以致病不是由于消耗细胞养分或通过毒素杀死细胞，而是利用细胞内物质占领空间，干扰细胞的代谢过程，促使细胞产生一些对细胞或生物的生命和正常功能有害的异常物质和条件，这使得植物病毒病的防治较其他植物病害防治更为困难，常给生产带来灾难的损失，被称为“植物的癌症”。,一、植物病毒的危害,植物病毒已超过600种，严重危害着农业生产。 在果树、蔬菜、花卉、林木以及农作物上皆有发现。随着生产栽培时间的推移，危害越来越严重，发现的病毒种类也越来越多。,病毒调查,危害园艺植物的病毒数目,如侵染菊花的病毒和类病毒有19种之多,如 无子病毒(CAV) 潜隐病毒(CLV) B病毒(CVB) 轻斑驳病毒(CMMV) 矮化病毒(CSV) 脉斑驳病毒(CVMV) 退绿斑驳类病毒(CCMV)等,4种对草莓生产造成重大影响: 斑驳病毒（SMoV） 草莓黄边病毒（SMYEV ） 草莓镶脉病毒（SVBV） 草莓皱缩病毒 （SCrV）、,甘薯根腐病.,甘薯叶点病,甘薯枯萎病,甘薯黑痣病,2.病毒的特性及其侵染,多植物病毒不经种子传播，多数以种子繁殖后代的植物，可以从轻度罹病植株上采集种子，播种繁殖，不会将病毒传至下一代。（专化性强的病毒除外，如豆类病毒由一种专化性强的蚜虫传播)可随着种子传播。） 对于有性生殖退化，仅能用无性繁殖方法繁殖的植物，一旦罹病则毫无办法。母株一旦染病，病毒在其细胞内增殖，并通过插条、接穗、种薯、球根、鳞片传至下一代。 通过昆虫作为媒介加速传播。,.植株脱病毒的意义,植物组织培养脱病毒技术是植物细胞工程的重要组成部分，脱毒种苗的生产在提高作物质量和产量方面已显示出极大潜力，良种、新品种的脱毒组培苗的大面积推广和应用，有效地解决了因病毒引起的品种退化问题。因此，植物组培脱毒技术在农业生产的科学化、现代化中具有巨大的应用价值和经济效益，还可减少农药的施用，改善生态环境条件，防止病害的蔓延与扩散，该方法已成为农业中应用最广泛的生物技术。,甘薯脱毒苗,脱毒区,第二节 脱除植物病毒的原理及方法,一、物理学方法： X射线 紫外线 超短波 高温 都能使病素钝化，其中以热处理最常用。,1.热处理脱除植物病毒的原理,病毒是DNA大分子，病毒进入植物细胞后；随植物细胞的DNA一起复制。热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去侵染的能力。 热处理是一种物理效应，与冷处理一样，它可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。,（1）温汤浸渍处理法：将剪下的接穗或种植材料，在50左右的温水中，浸渍3-15分钟至数小时。 （2）热风处理法：让盆载植物在35-40高温下生长发育，热处理空气温度应逐渐升高，然后达到所需温度，同时必须保持一定的湿度和光照，以后可切取处理后新长出的枝条作接穗和砧木，或将热处理与组织培养结合效果更好。,热处理脱毒,2、愈伤组织热处理脱毒法,方法：从患病植株上取叶片(茎片、鳞片、花器亦可)进行离体培养，诱导形成愈伤组织，然后将愈伤组织反复继代培养同时兼用热处理。 常用处理温度及处理时间： 温度：37-38 时间：处理2周、4周或8周 温度：50 时间：3-15min。 反复继代兼热处理，经历一定的时间(继代次数需试验)后，将热处理过的愈伤组织转移到分化培养基中，诱导器官分化。,果树作物：桃(无黄萎病)、苹果(花叶病)、葡萄(扇叶病毒)、甜橙、香蕉、李子、醋栗、梨、树莓、红莓苔子、草莓等。 蔬菜作物：马铃薯、番茄、菠菜。 花卉植物：蔓生长春花、康乃馨、菊花等。 其他植物：曼陀罗等。,例：烟草愈伤组织兼热处理钝化烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)获得无病毒株效果做法：,A：从患病烟草植株上取5mm叶片培养，在MS附加IAA 2+KT 0.2的培养基上诱导愈伤组织。 B：将其中一部分愈伤组织反复继代培养，继代培养中分别兼用25、30和37温度热处理8周。 C：将热处理后的愈伤组织，转到MS附加IAA 2+KT 2的分化培养基中诱导芽分化。 D：将1cm长的芽转移到MS附加IAA 2+KT 0.02生根培养基，诱导根分化。 E：完整植株获得后，移植到无毒土壤栽培并进行鉴定。 结果表明：反复继代培养可获得无病毒株。,3.低温处理脱出病毒,菊花植株-5,4-7.5个月处理后进行茎尖培养,可以除去矮化病毒(CSV)和褪绿班驳病毒(CCMV),而单独的茎尖培养无此效果。,二、化学方法,使用农药是防治植物真细菌病害的主要方法，理论上讲，也应该是防治病毒的有效途径。 有不少化学物质能抑制病毒复制，例如孔雀绿、硫尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、以及某些病毒抑制剂。 如Viraz01e(病毒唑)和一些蛋白质、核酸合成抑制剂等。由于病毒的复制和寄主的代谢过程关系非常密切，因此，要找出既干扰病毒复制，又不影响寄主细胞正常代谢的药剂十分困难。,利用这些化合物处理整株植物去病毒的效果虽不理想，但培养离体的组织、细胞和原生质体等却可能有良好效果。 如在培养基中加入2硫尿嘧啶可以除去烟草愈伤组织中的PVY病毒，加入放线菌素D可以抑制原生质体中的病毒复制等。,钝化、抑制和清除植物病毒的一些化合物,三、生物学方法,1.茎尖培养脱毒 （1）茎尖培养脱毒的理论基础 a、病毒在植物体内的转移是通过维营束系统完成的，在分生组织区域内没有维管束组织，病毒只能通过胞间连丝传递赶不上细胞的不断分裂和活跃的生长速度； b、在分裂旺盛的分生组织内，病毒的复制受到旺盛代谢活动的限制； c、在植物分生区域内，“病毒钝化体系”的活性较其他部位的活性高； d、茎尖分生组织内高浓度的植物内源激素可能会抑制病毒的增殖。,（2）茎尖培养脱毒苗的方法,在解剖镜下剥取茎尖。考虑到脱毒效果及提高成活率，一般切取0.20.5mm的茎尖为组织材料进行培养，不同的植物茎尖对外源激素的反应不同。 茎尖大小:过大时接种易成活，但脱毒效果差，过小时难成活，但脱毒效果好。一般以带有1-2片叶原基为好，大小为0.2-0.3mm为宜，超过0.5mm时，脱毒效果差。 培养基:只要能使茎尖快速生长，分化快的培养基均适于脱毒。一般以MS较好，添加一定比例的细胞分裂素就行。,马铃薯的芽,茎尖的结构,微茎尖,普通茎尖,马铃薯脱毒苗,康乃馨不同茎尖培养与康乃馨斑驳病毒的脱除情况,(3)茎尖培养法脱除植物病毒的技术关键,同一种病毒在不同植物体内分布部位不同。 例：烟草花叶病毒(TMV)在如下植物中的荧光反应。 烟草：l-4片叶原基中未见TMY特异荧光 撞羽矮牵牛：一两片叶原基未见TMV特异荧 光，而在三四片叶原茎中可见TMV荧光。 番茄：1片叶原茎中未见TMV特异荧光。 所以在用茎尖培养脱毒时，必须认真确定病毒在植物茎尖中的分布部位，然后确定培养茎尖的大小.,如：番茄：只能取生长锥或仅带一片叶原基的茎 尖进行培养； 撞羽矮牵牛：可取生长锥或带一两片叶原基 的茎尖进行培养； 烟草：可取带4片叶原基的茎尖进行培养。 利用茎尖堵养法脱除植物病毒时，最好找出茎原基所带叶原基的数目与生长点(茎尖)大小的相关性，这样在取材时就方便多了。,茎原基 0.050.08mm 茎原基带2片叶原基 0.10.2mm 茎原基带4片叶原基 0.30.4mm 茎原基带6片叶原基 0.60.8mm,不同病毒种类在同一种植物中分布部位不同。,甘薯 斑纹花叶病毒、缩叶花叶病毒： 分布于1.0- 2.0mm以内的茎尖中 羽毛状花叶病毒： 分布于0.3-1.0mm以内茎尖中 马铃薯 马铃薯卷叶病毒、Y病毒： 分布于1.0-3.0mm以内的茎尖中； X病毒：分布于0.2-0.5mm以内的茎尖 G病毒：分布于0.2-0.3mm以内的茎尖 S病毒：0.2mm以下,2.愈伤组织培养脱毒,植物各部位器官和组织培养去分化诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗。 说明病毒颗粒会在愈伤组织的培养过程中逐渐消失。,愈伤组织脱病毒的机理,可能的原因有： 病毒在植物体内不同器官或同一器官的不同组织中分布不均匀，由那些无病毒细胞增殖产生的愈伤组织就是获得无病毒苗的基础。 有些愈伤组织细胞中病毒浓度较低，在愈伤组织细胞快速分裂过程中，病毒的复制能力衰退或丢失。 继代培养的愈伤组织容易产生抗性变异细胞，因而可能出现不带病毒的愈伤组织。但经愈伤组织产生无病毒苗的脱毒途径容易产生变异，可能导致植株丧失其原有的优良性状，当然也有可能产生有益的变异，但频率极低。,3.茎尖微体嫁接脱毒,先将砧木种子进行表面消毒，以后再接到1%琼脂以MS无机盐培养基培养发芽，用苗龄约2周的幼嫩实生苗作砧木。 把实生苗从试管中取出，在无菌条件下切去顶部，留下1-1.5cm的上胚轴部分，将子叶和液芽除去，把根切短至46cm长。 从田间或温室旺盛生长的成年树剪取一小段新梢，经消毒后在超净台上用显微操作法取出仅带1-3个叶原基的茎尖约1mm大小作穗用。采用倒T字形的水平切口。 嫁接苗用液体滤低桥培养基培养。成活率30%50%，嫁接成功的植株移植到土壤之前至少要有两片展开的真叶。,苹果微体嫁接茎尖大小与脱毒成功率,苹果不同取材时期对微体嫁接成功率的影响,苹果微体嫁接茎尖大小与脱毒成功率,试管微体嫁接在果树方面发展最快,(1)嫁接植物不受与珠心及有性实生苗相关的幼年阶段的影响。 (2)许多栽培品种通过嫁接繁殖了许多世代，因此果树研究者和种植者关于这些品种的自根苗的根冠大小、病虫害情况以及耐寒性等了解得很少。,(3)茎尖组织培养繁殖结合热处理可产生无病毒植物，因此，许多研究者认为对通常采用嫁接繁殖的果树进行试管嫁接是很适宜的。 (4)试管微体嫁接除了可培育无病毒植株外，还可解决难以生根的园艺植物的生根问题和进行嫁接亲和力的研究。,4.珠心胚培养脱毒,柑桔类80%以上的种类具有多胚性,而单胚占的比例很小。 柑橘类植物中有不少多胚品种，一颗种子内除一个合子胚外，还有数个至数十个由珠心细胞形成的无性胚，称做珠心胚。 因为病毒通常是经维管束的韧皮组织传播的，而珠心与维管束系统无直接联系。由珠心组织诱导产生的植株就可免除病素毒的危害。,它与合子胚不同，不是受精的产物，而是由体细胞产生的，因此具有和母体相同的遗传组成； 与合子胚一样，在珠心胚和植株之间无维管组织连系，因此即使母体植株感染了病毒，珠心胚也是无毒的； 在自然条件下，珠心胚一般都不能发育成熟，只有适时从种子中剥离出来，接种在人工培养基上，珠心胚才能长成植株，而这些植株应当是不带病毒的母体无性系。,珠心胚具有3个特征,5.花药培养脱毒,花药培养的最初目的，是培育起源于花药内部花粉粒的单倍体植株，并使单倍体加倍，作为育种材料的来源。 但经大量实验表明花药培养所得的植株有95%以上是能开花结果的多倍体，而且生长发育都优于母株。 已证明，经愈伤组织培养出来的花药植株是不带病毒的，借此方法，不仅可快速培育出大量的无毒植株，并可省去病毒鉴定工作，对基层生产应用实为一举两得的事情。,三、分离茎尖的培养情况,第一种：是生长停止，接种的组织并有扩大，颜色逐渐变褐而枯死，这种情况大多是生长点在分离接种过程中受伤而造成的； 第二种：是生长太慢，茎尖接种后颜色逐渐变绿，但不见增大，最后成绿色小点。这是由于生长素浓度偏低，或培养温度过低所造成的，如果立即转入较高浓度生长素的培养基中，或提高培养温度，即能促进茎尖生长；,第三种：是生长过旺，接种后茎尖明显增大，约培养一同后即在茎尖基部产生愈伤组织，但不易见到茎尖的伸长，组织颜色也较浇。这是由于培养茎生长素浓度偏高，或光照弱，温度高而造成的。为此应将培养材料转入生长素浓度较低的培养基中，或降低温度，提高光照强度来解决。否则时间长了愈伤组织会表换生长分化能力； 第四种：是生长正常、在营养、激素、温度、光照等各方面条件正常的情况下，接种的茎尖颜色逐渐变绿，基部逐渐增大，有时形成少量的愈伤组织，茎尖也逐渐伸长，培养一个月左右转入无基素的基本培养基，茎尖继续伸长，并产生根系，最后发育成完整植株。,第三节 无病毒植株脱毒程序,一、材料准备 1决定植物种类及品种。选用生长健壮，遗传性一致的品种为材料，并探明该品种除所脱除 的病毒在寄主中的位置。 2了解该植物体内所具有的病毒种类及危害的程 度。根据植物所带病毒种类，选择指示植物(敏感植物)。 3决定脱除病毒的方法：“茎尖培养”还是“热处理”还是“微体嫁接”。,二、生长点分离和培养(茎尖培养为例),1从罹病的植株上切取顶芽或腋芽。 2材料表面灭菌、决定灭菌药剂、浓度、时间。 3根据病毒在寄主内分布位置决定切取茎尖大小。如果热处理，那么决定热处理的温度、时间。 4接种成功率与茎形状结构有关。 例 马铃薯、百合生长点呈半圆形较大、好分离。 番薯、矮牵牛、香石竹呈半圆形，也比较好分离。 大丽花、菊花生长点扁平、并被对生叶原基夹住难分离。 草莓，叶原基上生有密集茸毛，生长点埋在肉质凹形槽 内，不仅难分离且容易污染。,三、无病毒植物的鉴定,通过茎尖分生组织培养、热处理脱毒法、微体嫁接法而培养成的植株，不一定都是无病毒植株。 当前用于病毒检测的方法有如下3种： 血清鉴定法； 生物鉴定法(敏感植物或指示植物)； 电子显微镜鉴定法。 采用单一鉴定法并不十分可靠。特别是对一些特异性病毒，单一鉴定方法可靠性更差。最好三种方法同时鉴定，可以获得理想的结果。,(一) 指示植物鉴定法,1、原理 指示植物法是利用病毒在其它植物上产生的枯斑作为病毒种类鉴别的标准，也即枯斑和空斑测定法。,2、指示植物两种类型,一种是接种后产生系统性症状，出现在病毒扩展到的植物非接合部位，通常没有局部明显病斑； 另一种是只产生局部病斑，常由坏死、褪绿或环斑构成。 常用的指示植物：千日红、曼陀罗、豇豆、心叶烟、辣椒、莨菪等。,每种病毒都有自己的敏感植物如：,马铃薯病毒的敏感植物：千日红、黄花烟、心叶烟、 毛叶曼陀罗； 大蒜病毒的敏感植物：藜、千日红； 草莓病毒的敏感植物：威州草莓(从八倍体野生种选出)、野草莓、野红草莓等。 桃红叶病毒的敏感植物：旱金莲。 大丽花病毒的敏感植物：昆落阿藜、苋色藜、心叶烟、克里芙兰烟、矮牵牛、黄瓜。 香石竹病毒的敏感植物：昆落阿藜、苋色藜。 菊花病毒的敏感植物：矮牵牛、豇豆。,3、敏感植物鉴定病毒的方法：,A、摩擦接种法： 取培养植株的叶片榨汁，将其汁用摩擦法接种到各自的敏感植物上，然后视其病斑有无，来判断是否脱除了病毒。 接种后如若敏感植物叶片表现病斑，可根据病斑类型判断，还有哪种病毒没有脱除。,例：马铃薯体内各种病毒在其敏感植物上表现的症状： X病毒侵染千日红(叶片呈枯斑)； M、S病毒侵染千日红(叶片呈突起枯斑)； X病毒侵染黄花烟(叶片呈花叶)； Y病毒侵染黄花烟(叶片花叶或条斑或呈明显脉绿带)； X病毒侵染心叶烟(叶片呈花叶)； Y病毒侵染心叶烟(叶片呈条斑)；PG带毒体侵染心叶烟(叶片呈花叶)； M、Y病毒侵染毛叶曼陀罗(叶片呈枯斑)。 植物汁液摩擦接种后，如使千日红叶片呈枯斑，使黄花烟、心叶烟叶片呈花叶证明，该植物体内具有马铃薯X病毒。,B嫁接法： 有些病毒不是通过汁液传播，而是通过专门的介体传播。如草莓黄化病毒、草莓丛枝病毒是通过一种特殊的蚜虫为介体进行传播。 这种病毒的鉴定，需将培养植株的芽嫁接在敏感植物上，根据敏感植物的病症表现来判断是否脱除了病毒。,木本多年生植物及草莓等无性繁殖的草本植物通常采用嫁接接种的方法,以指示植物作砧木，被鉴定植物作接穗，可采用劈接、靠接、芽接等方法嫁接，其中以劈接法为多。 如草莓以对病毒敏感的欧洲草莓（野草莓）和深红莓作指示植物，从经脱毒得到的植株上仅取成龄叶片顶端一小叶作接穗，叶柄用刀片削成楔形，削面长810 mm，然后迅速将接穗小叶的叶柄插入切口，用塑料绑缚接合部，嫁接后4周，若带有病毒，则在新展开的叶片、匍匐茎或老叶上会出现病征,（二）抗血清鉴定法,1、基本原理： 当动物被病毒感染或人工注射异体蛋白质时，在动物体内会产生一种特异性丙种球蛋白称为免疫球蛋白，即所谓“抗体”。 引起形成抗体的物质(病毒或异体蛋白)称为“抗原”。,抗原和抗体结合，表现为很强的特异性。即由一种病毒产生的抗体，只能结合该种病毒。抗体在特殊细胞内形成，进入血液存在于血清和体液内。 这种含有特异性“抗体”的血清称为“抗血清”。抗原和抗体相结合的反应称为“血清反应”。,2.病毒抗血清在诊断上的价值。,A.病毒抗血清具有高度的专化性。即由一种病毒产生的“抗体”，只能结合该种病毒(抗原)。如由注射(感染)TMV而产生的抗体(免疫球蛋白)，只能检测TMV病毒(才可能发生血清反应)。 B由于“抗血清”法具有高度专化性，因此对于那些受感染而没有症状的带毒植物，也能诊断，故在实用上具有很高的价值。 C由于病毒与“抗血清”的“反应量”与病毒浓度成正比。只要知道其中一种浓度，可根据反应量来测定另一种的浓度。故此可以用来作病毒的定量分析。,3.病毒抗血清在诊断上的局限性：,A.不是所有病毒都能制成抗血清，一般“黄化型”病毒，或严格由专化性昆虫传播的病毒。如马铃薯卷叶病毒极难或不能获得“抗血清”。 B病毒在寄主体内含量太少，而提纯过程中丧失又太多。或者提纯过程中，病毒质粒丧失了必备的抗原结构。 C植物体内具有单宁物质，单宁与病毒结合，使病毒丧失了抗原性质。,4.方法,抗血清鉴定首先要进行抗原的制备，包括病毒的繁殖、病叶研磨、汁液的澄清、病毒悬浮液的提纯、病毒的沉淀等过程。只有获得高纯度的抗原，才有可能获得高度纯净的抗血清。 一般采用家兔制备抗植物病毒的抗血清，以924个月大小的家兔为好，注射病毒悬浮液，在家兔饥饿12 h后采血，再进行抗血清的分离和吸收等过程。血清可分装在小玻璃瓶中，贮存在1520 的冰冻条件下，也可以分装在安瓶中，冷冻干燥，然后密封，有效保存。,具体测定可采用沉淀反应、凝集反应、免疫扩散、免疫电泳、荧光抗体技术和酶联免疫吸附试验等多种方法。,酶联免疫吸附法 (enzyme 1inked immunOsOrbentassay，EL工SA),酶联免疫吸附法是把抗原抗体的免疫反应与酶的催化反应相互结合而发展起来的一种综合性技术，它的灵敏度高，特异性强，特别是当寄主体内病毒浓度很低或同时存在病毒钝化物或抑制剂时，它的优势尤为明显，因而是近年来病毒检测方法中发展最快、应用最广的一种方法。,酶联免疫吸附法的原理,利用以酶标记的特异抗体来指示抗原抗体的结合，从而检出样品中的抗原。 具体操作程序是：将待检植物汁液(抗原)注入酶联板(聚苯乙烯多孔微量反应板)中，使抗原吸附于它的孔壁，然后加入以酶标记的特异抗体，待抗原与抗体充分反应后，洗去未与抗原结合的多余酶标记抗体，于是在固相载体酶联板表面就只留下以酶标记的抗原抗体复合物。这时加入酶的无色底物，复合物上的酶催化底物降解，生成有色产物。这一结果可用肉眼识别，也可用分光光度计对底物的降解量进行测定。,血清鉴定法,血清鉴定的基本方法,A.玻璃片凝集法 在清洁玻璃片的一端，用毛细管滴加5滴稀“抗血清”，另一端滴加等量对照血清。然后各加滴被检植物压榨出的原汁液两滴。用玻璃棒搅匀，在常温下静置20-50min，然后在40-60倍显微镜下观察。带病毒的叶绿体发生典型的凝集现象。,玻璃片凝集法,B微量凝集试验(MAT) 在培养皿底部，铺上一层火棉胶或聚乙烯醇缩甲醛薄膜，然后将抗血清滴入薄膜上，再在血清液滴上方覆盖一层石蜡油。在2025下保温，20-50min后观察。 此法优点：鉴定时可以完全避免蒸发，抗血清用量少，每毫升抗血清可滴加150次，每培养皿可以鉴定几十个样品。对某些病毒(马铃薯M病毒)引起的细微病毒凝聚现象均可识别。,（三） 电子显微镜检查法,采用电子显微镜，可以通过直接观察，检查出有无病毒存在，并可以得知有关病毒颗粒的大小、形状和结构,又可以鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的方法，但需一定的设备和技术。 。 病毒 形态 长(nm) 宽（nm） X 线 状 515 13 Y 线 状 730 11 A 线 状 730 11 S 线 状 650 1213 M 线 状 650 1213,灵敏度高和能在植物粗提取液中定量测定病毒。 目前运用负染和超薄切片电镜观察能够诊断和鉴别病毒到属的水平。 1973年，Derrick把电镜与免疫学技术相结合，建立了更为灵敏的免疫吸附电镜技术，该技术已成为植物病毒研究的一个重要手段。,方法的优点,(四)分子生物学方法,在植物病毒鉴定中采用的分子生物学方法主要是检测病毒的核酸。 一般都具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等特点。 核酸杂交技术的原理:采用带有放射性或非放射性物质标记的已知序列核酸单链作为探针，在一定条件下与靶病毒的核酸单链退火形成杂交双链。通过杂交信号的检测，鉴定样本中有无相应病毒的基因。,19世纪末以来，许多国家开始用聚合酶链式反应(PCR)技术检测果树病毒，并取得很好的效果。 常用的有聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术，即利用已知病毒的核苷酸序列或同组病毒的相似序列区域来设计引物，将待测样品用PCR技术体外扩增DNA，扩增后的产物可进行限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA RAPD)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、变性梯度凝胶电泳(denaturing grade gel electrophoresis，DGGE)、单链构象多态性(single-strandconformation polymorphism，SSCP)、探针交叉杂交等技术分析检测病毒是否存在。,由于多数植物病毒核酸是RNA，在进行PCR检测前，需以RNA为模板，经逆转录生成cDNA后，再利用病毒核酸特有的序列设计的引物进行PCR反应，即可知道在寄主中是否有病毒存在。 RNA病毒和类病毒等在寄主体内可形成双链RNA(dsRNA)，而一般情况下植物体内不存在dsRNA，因此dsRNA分析也可用于植物病毒鉴定。,利用DNA杂交和荧光标记技术相结合的基因芯片技术也是植物病毒快速检测的重要发展方向。 在实际应用中，为了提高检测的可靠性，往往用几种方法同时鉴定。最后选择出的无毒苗即可进行扩增繁殖，用于生产。但在无毒种苗的扩增繁殖和应用过程中应注意防止再度感染。,植物脱毒苗生产应用尚不普遍，原因如下： 基础研究跟不上，诸如病毒特性与寄主的关系，各植物种体内都有什么病毒等。 脱毒培养后如何快速检测。 得到脱毒原种苗后，如何保存?如何防止再度侵染等。,四、无毒原种苗的繁殖,经茎尖培养法，热处理法、微体嫁接法获得的无病毒株数量是很有限的，需扩大繁殖才能满足生产需要。 一方面充分发挥组织培养作用，在室内加速繁殖；另一方面加速田间繁殖。 与此同时对脱毒株系进行植物学性状鉴定，遗传稳定性鉴定，并根据病毒鉴定结果，淘汰有毒株系，保留性状优良无毒株系。,五、无毒原种的保存,无毒植株并不具有额外的抗病性，它们有可能很快又被重新感染。为了解决这个问题，应将无毒原种种在温室或防虫罩内灭过菌的土壤中。 在大规模繁殖这些植物的时候，应把它们种在田间的隔离区内，其中应很少有或完全没有重新感染的机会。 另外一种更容易也是更便宜的方法，是把由茎尖得到的并已经过脱毒检验的植物通过离体培养进行繁殖,六、脱毒植株的应用,在研究特定病毒对寄主植物的影响时，无毒植株是非常有用的实验材料。 更重要的是，主要是通过茎尖培养所得到的无毒植株的发育情况表明，很多病毒能在寄主植物中造成生活力、品质和产量的严重损失。 通过把已知病毒引入无毒植株，并比较同一个无性系的感病株和无毒株的表现，可以对病毒造成的产量损失做出更精确的估计。,通过茎尖培养的方法，Stone(1973)由个品种的水仙中获得了一个无阿拉伯花叶病毒和水仙退化病毒的无性系。 这种无毒鳞茎比普通原种长得快，生活力强，比受侵染的植株花大，颜色丰富，每个茎的花多。大黄脱毒后叶柄产量增加了6090。 天竺葵的很多品种带有不表现症状的病毒。据报道，由其茎尖培养产生的植株比未受过处理的植株生活力强，产生插条的数目多20一30，而且这些插条很容易生根。,七、病毒以外病原菌的离体消除方法,茎尖培养和愈伤组织培养主要用于消除病毒，但有些证据表明，也可通过培养消除其他病原菌如类菌质体、细菌和真菌。 jacoli(1978)指出，胡萝卜外植体经过反复转管后，其中感染的星黄菌(类菌质体状小体)逐渐退化并在80d内消失。,培养的植物组织内带有的细菌和真菌，由于在培养基上增殖很快，在一般情况下很容易表现出来。 通过茎尖培养已经在花叶万年青和天竺葵中消除了这类周身侵染的细菌。 在康乃馨中已经消除了由蔷薇镰孢霉引起的茎腐病。,无毒种苗在实际应用中的问题是再度感染，如何防止再度感染，必须建立一种体系。 在这种体系中应做到：研究、繁殖、生产严格分工。原原种和原种的繁殖，必须在隔离的网室中进行；良种的繁殖，可采用集团隔离即在无毒源和其他病虫害的大田中进行。良种提供农家生产，经23年后再度感染，可全部更新。,(1)热处理为什么可以去除部分植物病毒?热处理方法分为几种，常用的是哪一种? (2)如何鉴定茎尖培养而成的脱毒苗确实是无毒的? (3)为什么用微茎尖组织培养形成的试管苗一般是无毒的?,思考题,