生物化学课件蛋白质结构与功能.ppt

五、蛋白质的结构,蛋白质是由一条或多条多肽链以特殊方式组合成的生物大分子。 蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿(dalton,d)以上的多肽称为蛋白质。 蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到100万道尔顿甚至更大。,1.构型和构象,构型(configuration)：立体异构体分子中取代原子或者基团的取向。这种排列的改变会牵涉到共价键的形成和破坏，但与氢键无关。例如氨基酸的D-和L-型。 构象(conformation)：取代基团单键旋转时形成的不同的立体结构，这种空间位置的改变会牵涉到氢键的形成和破坏，但共价键不被破坏。,一级结构 二级结构 三级结构 四级结构,aa顺序 -螺旋 多肽链 寡聚蛋白 （单体蛋白或亚基）,2.蛋白质的一级结构,蛋白质的一级结构(primary structure)指蛋白 质分子中氨基酸残基的排列顺序。 蛋白质的化学结构包括组成蛋白质的多肽链 数目，多肽链的氨基酸序列，以及多肽链内 或链间二硫键的数目和位置。 二硫键（disulfide bond）：由肽链中相应部 位上两个半胱氨酸残基的侧链脱氢形成。,链间 二硫键,链内 二硫键,我国1965年在世界上第一个用化 学方法人工合成这种牛胰岛素。,牛胰核糖核酸酶的一级结构,（1）蛋白质样品的预处理； （2）测定每条多肽链的氨基酸组成； （3）测定多肽链的N-末端和C-末端； （4）应用两种或两种以上不同的水解方法将所要测定的蛋白质断裂，各自得到一系列大小不同的肽段； （5）分离提纯所产生的肽，并测定它们的序列； （6）从有重叠结构的各个肽的序列中推断出蛋白质中全部氨基酸顺序。,蛋白质一级结构测定的步骤,（3）分析多肽链的N-末端和C-末端;,N-端氨基酸分析法： DNFB法、Edman法、氨肽酶法（肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解）,C-端氨基酸分析法： 羧肽酶法（肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的向里水解）、肼解法,肼解法,多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物；肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,3、多肽链折叠的空间限制,肽键带有双键的性质，主链上1/3的键不能自由旋转。肽键中的四个原子和它相临的两个C原子都处于一个平面上（酰胺平面）。,多肽链通过可 旋转的- 碳 原 子连接的酰胺平面链,二个肽平面旋转时受到C原子上侧链R基空间位阻的影响。,蛋白质的二级结构,蛋白质的二级结构(Secondary Structure) 是指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕方式。 它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。 主要有-螺旋、-折叠、-转角、无规卷曲等。,（1）-螺旋(-helix) 最常见,多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个Aa残基；两个Aa之间的距离为0.15nm； Aa残基侧链伸向外侧，相邻的螺圈之间形成链内氢键； 天然蛋白质的-螺旋通常都是右手-螺旋。,氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第五个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键。,-螺旋有左旋和右旋两种，右旋比左旋更加稳定，因此也更常见。,影响-helix不稳定的因素：,a. 多肽链中连续存在带相同电荷的氨基酸； b.多肽链中有Pro时，则helix中断，产生一个“结节”；,c. R基团太大，造成空间阻碍作用。,（2）折叠(pleated sheet),两条或多条几乎完全伸展的肽链通过链间的氢键交联而形成的； 肽链的主链呈锯齿状折叠构象，R基团处于折叠平面的两侧。,平行式,反平行式,折叠中的 氢键与-螺 旋中的氢键有 何不同？,（3）转角（turn）或迴 转结构（reverse turn）,多肽链经常出现180°的回折，这个回折角就是 转角结构； 它由四个Aa残基组成; 回折处的第一个Aa残 基的 -C=O 和第四个 Aa残基的 N-H 之间 形成氢键，形成一个不很稳定的环状结。,（4）无规卷曲（nonregular coil） 或自由回转（random coil),没有一定规律的松散的肽链结构，通常酶的活性中心常处在这一构象区域里。,转角,折叠,螺旋,无规卷曲,4.超二级结构和结构域,超二级结构(supersecondary structure)： 是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼 此相互作用，形成有规则的，在空间上能 辨认的二级结构组合体。通常有， ， 。,×,结构域（domain） ：是在超二级结构 基础上进一步卷曲折叠成紧密的近似 球状的结构，在空间上彼此分隔，各 自具有部分生物功能的结构。,由4个 组成的/ 桶结构域,/桶结构域：丙酮酸激酶,小的蛋白质分子只有一个 结构域 结构域三级结构 大的蛋白质分子有数个结 构域,丙酮酸激酶,己糖激酶,前清蛋白,肌红蛋白,免疫球蛋白,5.三级结构（Tertiary Structure）,在二级结构基础上，肽链不同区段的侧链基团相互作用，进一步盘绕、折叠形成的的空间结构。 维系这种特定结构的力主要有氢键、疏水键、离子键、范德华力和二硫键、配位键等。,肌红蛋白,辅基血红素结构图,多肽链,疏水键,氢键,二硫键,离子键,CH2OH,CH2OH,范德华力,维持三级结构的作用力,6.四级结构（Quaternary Structure）,由两条或两条以上具有三级结构的肽链聚合而成的特定构象的蛋白质分子叫蛋白质的四级结构； 其中具有独立三级结构的一条肽链叫亚基（subunit)，无生物功能； 由几个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白。,4个亚基缔合而成 2种亚基（、） 亚基呈球形 亚基间靠次级键连接 亚基两两相同，分别 为1 、2、1、2 每个亚基都含有一个 血红素辅基,血红蛋白,氨基酸序列大 不相同，但结 构（三级）相 似，功能也相 似（载氧） 结构决定功能,维持蛋白质结构的作用力,一级结构：肽键、二硫键（都属于共价键） 二级结构：氢键（主链上C=O和NH之 间形成） 三、四级结构：次级键（氢键、疏水键、 离子键、范德华力、配位键）,7.蛋白质结构与功能的关系,a.同源蛋白质中氨基酸顺序的种属差异 同源蛋白质（homologous protein）：指不同的有机体中实现同一功能的蛋白质。 例如：胰岛素和细胞色素C,（1）蛋白质的一级结构与功能的关系,b.同种蛋白质中氨基酸顺序的个体差异（分子病） 血红蛋白的一级结构变化引起镰刀型贫血病,正常细胞 镰刀形细胞,血液中大量出现镰刀 型红细胞，患者因此 缺氧窒息； 它是最早认识的一种 分子病。流行于非洲，死亡率极高，大部分患者童年时就夭折,活过童年的寿命也不长，它是由于遗传基因突变导致血红蛋白分子 结构的突变。,正常型链 -Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys - HbA 谷氨酸 镰刀型链 -Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys - HbS 缬氨酸,谷A（极性） 缬A（非极性） (了解)由于缬氨酸上的非极性基团与相邻非极性基团 间在疏水力作用下相互靠拢，并引发所在链扭曲为束 状，整个蛋白质由球状变为镰刀形，与氧结合功能丧 失， 导致病人窒息甚至死亡，但病人可抗非洲疟疾。,（2）蛋白质构象与功能的关系,蛋白质构象并不是固定不变的，有些蛋白质表现其生物功能时，构象发生改变，从而改变了整个分子的性质，这种现象称为别构（变构）现象。 别构蛋白各部位之间的影响是通过构象变化传递的，这种构象变化可以从一个亚基传到另一个亚基，引起协同的相互作用。 以血红蛋白的载O2为例,血中氧分子的运送：,任何一个亚基接受氧分子后，会增进其它亚基吸附氧分子的能力,环境氧低时 Hb 迅速释放氧分子,动脉,环境氧高时 Hb 快速吸收氧分子,(R) 松弛态,(T) 紧张态,静脉,释放氧分子后 Hb 变回 T 态,六、蛋白质的重要性质,蛋白质由氨基酸组成，和氨基酸一样， 是两性电解质。 可解离的基团有： 肽链末端的-氨基和-羧基； 侧链基团,1.蛋白质的两性电离和等电点,蛋白质在某一pH时所带的净电荷为零，在电场中既不向阳极，也不向阴极移动，这一pH称为蛋白质的等电点（pI)。 蛋白质带电的多少，带电的符号与溶液的pH值有关。,等电点与等离子点,中性盐的存在常导致蛋白质的等电点发生明显的改变 实际测得的等电点与介质的离子组成有关 在不含任何盐的纯水中测得的等电点称为蛋白质的等离子点，是蛋白质的特征常数,pI时，蛋白质的溶解度、粘度、渗透压、导电能力及膨胀性最小。 pI的应用： 溶解度最小分离提纯蛋白质（沉淀法） 带电性质分离鉴定蛋白质（电泳法）,2.蛋白质的胶体性质,蛋白质是高分子化合物，在水溶液中形成的颗粒具有胶体溶液的特征如布朗运动、丁达尔现象、电泳现象,不能透过半透膜,并具有吸附能力。 由于蛋白质不能透过半透 膜，因此可用羊皮纸、玻 璃纸等将非蛋白的小分子 杂质除去（透析法）。,蛋白质颗粒表面带有很多极性基团， 形成水膜（水化层）； 同种蛋白质带有同种电荷，相互排斥。,蛋白质胶体溶液比较稳定的原因是：,3.蛋白质的沉淀作用,蛋白质在水中形成了稳定的胶体， 如果加入适当的试剂，破坏了蛋 白质的水膜（水化层）或中和了 蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶 液就不稳定而出现沉淀。,蛋白质的沉淀作用,分类： 可逆沉淀：在沉淀过程中，蛋白质的结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液。 不可逆沉淀：在沉淀过程中，蛋白质的结构和性质都发生了变化，沉淀不可能再重新溶解于水, 加入中性盐 若在蛋白质溶液中加入少量的中性盐，则蛋白质的溶解度会增加，这种现象叫盐溶。,分子在其pI时，容易互相吸引，聚合沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。,3.蛋白质的沉淀作用,若在蛋白质溶液中加入大量的中性盐，使蛋白质沉淀析出的现象叫盐析。（用于分离纯化蛋白质）,蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多水分子，当盐浓度高时，这些水分子被盐抽出，暴露出的疏水区域相互结合，形成沉淀。,加入有机溶剂,向蛋白质溶液中加入有机溶剂（如甲醇、乙醇、丙酮）会使蛋白质沉淀，原因是： 这些有机溶剂与水的亲和力大于蛋白质，破坏了蛋白质周围的水膜； 有机溶剂的介电常数比水小，导致溶液的极性减小，增加了蛋白质之间的静电吸引力，从而聚集沉淀。,加入重金属 如HgCl2 、AgNO3 、Pb(Ac)2 、FeCl3 等 与蛋白质中带负电荷的基团形成难溶盐 加入生物碱和某些酸类 如：秋水仙碱，茶碱 如：鞣酸、单宁酸、苦味酸、三氯醋酸 与蛋白质中带正电荷的基团形成难溶盐,哪些沉淀为可逆沉淀？ 哪些沉淀为不可逆沉淀（变性沉淀）,4.蛋白质的变性和复性,天然蛋白质受到理化因素的影响，分子内部严格的空间结构受到破坏，从而引起蛋白质的理化性质和生物学性质发生改变，但并不导致蛋白质一级结构的破坏，这种现象称为蛋白质变性作用。,蛋白质变性的因素有： 物理因素加热（70100）、剧烈振荡或搅拌、紫外线、X射线、超声波 化学因素强酸、强碱、尿素、胍、去污剂、甲醛、重金属盐、三氯醋酸、磷钨酸、苦味酸、浓乙醇,蛋白质变性的本质是： 维持蛋白质高级结构的次级键被破坏； 蛋白质分子从有序卷曲结构变为无序松散结构； 一级结构没有变化，分子量和分子组成不变。,变性蛋白的特征： 生物活性丧失（最主要）； 理化性质改变溶解度下降，易沉淀、结晶能力丧失、粘度增加、扩散速度下降等; 生化性质改变肽链松散、反应基 团增加、易被蛋白酶水解。,变性条件若不过于激烈，一旦条件去除，则变性蛋白恢复原来的构象，这种现象叫作变性蛋白的复性作用(renaturation)。 随变性时间的增加、变性条件的加剧及变性程度的加深，复性的可能性逐渐降低,核糖核酸酶A,沉淀的蛋白质不一定变性，如盐析作用 变性的蛋白质也不一定沉淀，如牛奶加热沸腾,思考： 蛋白质变性与沉淀之间的关系,？,5.蛋白质的颜色反应,双缩脲反应(Biuret Reaction) 双缩脲在碱性溶液中与CuSO4作用产生紫红色络合物的反应称双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多类似双缩脲结构的肽键,所以也能发生双缩脲反应。(可定性定量分析蛋白质）,黄色反应 蛋白质遇浓硝酸会变黄，这一反应为Phe、 Tyr、Trp等含苯环的氨基酸所特有。,米伦氏反应(Millon Reaction) 蛋白质溶液中加入米伦试剂(HgNO2 、HgNO3 、 HNO3和HNO2的混和液)，产生白色沉淀，加热 则变为红色沉淀，此为Tyr的酚基所特有的 反应，因此含有Tyr的蛋白质均有此反应。,水合茚三酮反应(Ninhydrin Reaction) 氨基酸与水合茚三酮作用时，产生蓝紫色反应，由于蛋白质是由许多氨基酸组成的，所以也呈此颜色反应。(可定性定量分析蛋白质）,其他颜色反应 乙醛酸反应会产生紫色环，用于鉴定含Trp的 反应；坂口反应会产生红色产物，用于鉴定 含Arg的反应；酚试剂反应是酚试剂与蛋白质 反应产生蓝色化合物。,6.蛋白质的紫外吸收,大部分蛋白质均含有带芳香环的Phe、Tyr、Trp(共轭双键体系)。 这三种氨基酸在280nm 附近有最大吸收峰，因此大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。 定量可能测不准,