淫羊藿总黄酮延长果蝇寿命及其分子机制.pdf
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1、淫羊藿总黄酮延长果蝇寿命及其分子机制 沈自尹 袁春燕1 黄建华 郭爱克1 胡作为 (复旦大学附属华山医院, 上海 200040) 摘 要 目的 在整体动物水平研究淫羊藿总黄酮 (EF) 延缓衰老的效果和分子机制。方法 采用果蝇寿命实验, 观察 EF 延长果蝇寿命的 效果; 采用果蝇全基因组寡核苷酸芯片研究 EF 延缓衰老的机制。结果 空白对照组、 Vit E 组、 EF 低剂量组及高剂量组平均寿命分别为 (34. 90 23. 04) ,(35. 25 23. 41) ,(41. 48 25. 00) 和 (46. 23 26. 20)d, 高低剂量 EF 均显著延长果蝇的平均寿命 (P 0.
2、 01 或 P 0. 05) , 高剂量 EF 提高平 均寿命 32. 46%。老年果蝇呼吸链相关酶、 蛋白分解酶、 促凋亡基因上调 2 倍以上, 而自由基清除酶、 抗凋亡基因、 内分泌免疫相关基因下调 2 倍以 上。EF 能下调老年果蝇呼吸链相关酶而上调自由基清除酶基因, 下调蛋白分解酶基因, 能上调促进细胞周期、 抗凋亡、 免疫相关基因。结论 老年 果蝇存在自由基产生过多而清除减少、 凋亡加速、 蛋白溶解过度、 内分泌免疫功能低下的内在机制, EF 通过减少自由基的产生, 增加自由基的清除, 减少蛋白分解, 促进细胞增殖, 恢复免疫功能、 对抗凋亡而发挥延缓衰老的功效。 关键词 淫羊藿总黄
3、酮; 衰老; 基因表达谱; 自由基; 果蝇 中图分类号 R339. 3 +4 文献标识码 A 文章编号 1005-9202 (2005) 09-1061-03 The efficacy of epimedium flavonoids on senescence-delaying in drosophila and its underlying molecular mechanisms SHEN Zi-Yin, YUAN Chun-Yan, HUANG Jian-Hua, et al. Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, Ch
4、ina 【Abstract】 Objective To investigate senescence-delaying efficacy of epimedium flavonoids (EF)and the underlying mechanisms in model organism drosophila. Methods The effect of EF on longevity of drosophila was detected by lifespan test,and the mechanisms were probed using oligonucleotide microarr
5、ay. Results Average longevity in control, Vit E group, low- and high-dose EF group was 34. 90 23. 04, 35. 25 23. 41, 41. 48 25. 00, 46. 23 26. 20 days, respectively. The longevity was increased by high-dose EF by 32. 46%(P 0. 01 or P 0. 05) . The old drosophila displayed up-regulation of respiratory
6、 chain related enzymes, proteases, pro-apoptotic genes by 2-fold or more. While enzymes responsible for removal of oxygen free radicals, anti-apoptotic genes, endocrine and immunity related genes were down- regulated by 2-fold or more. After treatment by EF, respiratory chain related enzymes and pro
7、teolysis enzymes were decreased and enzymes responsible for removal of oxygen free radicals, cell cycle promoting genes, anti-apoptic genes and immunity related genes were increased. Conclusions Senile drosophila have inherence mechanism of excessive production of free radicals and less decreased re
8、moval of it, excessive apoptosis, proteolysis and deficiency of immunity. EF can decrease production and increase removal of free radicals, promote cell prolifera- tion, recover immune function and withstand apoptosis to achieve senescence-delaying efficacy. 【Key words】 Epimedium flavonoids;Senescen
9、ce;Gene expression profiling;Oxygen free radicals;Drosophila 1 中国科学院上海生命科学院神经科学研究所 作者简介: 沈自尹 (1928-) , 男, 教授, 中国科学院院士, 从事中医 “证” 本 质及延缓衰老研究。 我们研究发现淫羊藿总黄酮 (EF) 能重塑老年大鼠 T 淋巴 细胞凋亡相关基因的平衡而延缓免疫衰老 1; 激活下丘脑的众 多神经递质, 通过 HPAT 轴的下行通路上调老年大鼠衰退的生 长激素轴、 性腺轴、 免疫功能, 表现出延缓神经内分泌免疫衰老 的功效 2, 进而在细胞模型中观察到 EF 能显著延长人二倍体 成纤维
10、细胞的传代次数和延缓其端粒缩短 3。本研究在生物 整体水平研究 EF 对果蝇寿命的影响, 并用基因表达谱探索 EF 延缓衰老的分子机制。 1 资料与方法 1. 1 果蝇 选用野生型柏林种黑腹果蝇 (Drosophila melanol- gaster) , 在 25、 相对湿度 40% 条件下培养, 果蝇按照 14: 10 h 的明暗周期于每日晨 7 点果蝇接受日光照明, 选用德国维尔兹 堡食物配方饲养。实验分为四组: 老年对照组、 维生素 E 组 (Vit E 组; 1%, 每百克培养基含 VitE 1 mg) 、 EF 低剂量组 (1%, 每百克培养基含 EF 1 mg) 、 EF 高剂量
11、组 (4%, 每百克培养基含 EF 4 mg) , 每组 200 只果蝇。 1. 2 药物 EF 采用辽宁产朝鲜淫羊藿, 由上海市医药工业研 究院中药室提取。 1. 3 果蝇寿命实验 收集羽化 8 h 的成虫, 5% 二氧化碳麻 醉, 放大镜下鉴别雌雄后, 选取雄性果蝇。药物均加入培养基 中, 果蝇自由取食。各组果蝇每周换培养基两次, 并计数死亡 只数, 实验至果蝇全部死亡结束。计算各组果蝇平均寿命、 最 高寿命。 1. 4 基因表达谱检测 果蝇喂养及药物剂量同果蝇寿命实 验, 不计算死亡只数, 在实验第 50 天时, 收集每组存活果蝇 120 只。并另取孵育后 1 d 的果蝇 120 只作为
12、青年对照组。用 TR- Izol reagent(Invitrogen) 提取总 RNA, 用 RNeasy Mini Kit 纯化总 RNA (QIAGEN) , 取 5 16 g 总 RNA 用 Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit 进行 1 st cDNA 的合成, Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit 进行 2 nd cDNA 的合成, 用 GeneChip IVT Labeling Kit) 进行 IVT 合成 cRNA, 片段化 cRNA, 取 15 g 片断 化 cRNA 与美国 Affymetr
13、ix 公司果蝇芯片 GeneChip (r)Drosoph- ila Genome 2. 0 Array 杂交。洗涤、 扫描等过程遵守 Affymetrix 1601沈自尹等 淫羊藿总黄酮延长果蝇寿命及其分子机制 第 9 期 公司基因表达操作程序。基因表达数据分析采用 Affymetrix 公 司 GCOS 软件, 基因差异表达 (上调或下调) 2 倍以上为有意 义。基因功能分析采用 Affymetrix 网上分析系统 ( http: / / www. affymetrix. com/ analysis/ index. affx) 。 1. 5 统计学方法 用 SPSS 12. 0 软件, 采
14、用单因素方差分析。 2 结 果 2. 1 寿命实验 与空白对照组比较, 高、 低剂量 EF 均显著延 长果蝇的平均寿命和最高寿命 (P 0. 05) , EF 延长果蝇寿命显 示一定程度的量效关系, 高剂量组效果更为明显, 提高寿命百 分率为 32. 46% (表 1) 。我们将全程果蝇生存情况作存活果蝇 只数和喂养时间的曲线, 显示自喂养 EF 10 d 左右, 两个 EF 组 存活果蝇只数明显多于空白对照组和 VE 组, 提示 EF 延缓衰 老在果蝇的青年时期即开始 (图 1) 。 2. 2 基因表达谱结果 2. 2. 1 基因表达特征 老年果蝇上调的基因有 1 592 个, 下 调的有1
15、 197 个, 利用 Affymetrix 公司的网上分析系统对差异表 达基因进行功能分析, 老年果蝇的基因表达呈现规律如下: 呼吸链相关的多种氧化还原酶上调, 而自由基清除酶类表达下 调, 如 cytochrome P450-4d1、 6a8、 4p1 及 NAD- dependent methyl- enetetrahydrofolate dehydrogenase 这些细胞呼吸链复合体成分均 上调; 而三个主要的自由基清除酶类如 Mn-SOD、 Cu-Zn-SOD 下 调; 多种蛋白分解酶表达上调; 促凋亡基因上调如具有 caspase 活性的 dream 基因上调, 而抗凋亡基因如基质
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- 淫羊藿 黄酮 延长 果蝇 寿命 及其 分子 机制
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