淫羊藿总黄酮延长果蝇寿命及其分子机制.pdf

淫羊藿总黄酮延长果蝇寿命及其分子机制 沈自尹 袁春燕1 黄建华 郭爱克1 胡作为 （复旦大学附属华山医院， 上海 200040） 摘 要 目的 在整体动物水平研究淫羊藿总黄酮 （EF） 延缓衰老的效果和分子机制。方法 采用果蝇寿命实验， 观察 EF 延长果蝇寿命的 效果； 采用果蝇全基因组寡核苷酸芯片研究 EF 延缓衰老的机制。结果 空白对照组、 Vit E 组、 EF 低剂量组及高剂量组平均寿命分别为 （34. 90 ± 23. 04） ，（35. 25 ±23. 41） ，（41. 48 ±25. 00） 和 （46. 23 ±26. 20）d， 高低剂量 EF 均显著延长果蝇的平均寿命 （P 0. 01 或 P 0. 05） ， 高剂量 EF 提高平 均寿命 32. 46%。老年果蝇呼吸链相关酶、 蛋白分解酶、 促凋亡基因上调 2 倍以上， 而自由基清除酶、 抗凋亡基因、 内分泌免疫相关基因下调 2 倍以 上。EF 能下调老年果蝇呼吸链相关酶而上调自由基清除酶基因， 下调蛋白分解酶基因， 能上调促进细胞周期、 抗凋亡、 免疫相关基因。结论 老年 果蝇存在自由基产生过多而清除减少、 凋亡加速、 蛋白溶解过度、 内分泌免疫功能低下的内在机制， EF 通过减少自由基的产生， 增加自由基的清除， 减少蛋白分解， 促进细胞增殖， 恢复免疫功能、 对抗凋亡而发挥延缓衰老的功效。 关键词 淫羊藿总黄酮； 衰老； 基因表达谱； 自由基； 果蝇 中图分类号 R339. 3 +4 文献标识码 A 文章编号 1005-9202 （2005） 09-1061-03 The efficacy of epimedium flavonoids on senescence-delaying in drosophila and its underlying molecular mechanisms SHEN Zi-Yin， YUAN Chun-Yan， HUANG Jian-Hua， et al. Huashan Hospital， Fudan University， Shanghai 200040， China 【Abstract】 Objective To investigate senescence-delaying efficacy of epimedium flavonoids （EF）and the underlying mechanisms in model organism drosophila. Methods The effect of EF on longevity of drosophila was detected by lifespan test，and the mechanisms were probed using oligonucleotide microarray. Results Average longevity in control， Vit E group， low- and high-dose EF group was 34. 90 ±23. 04， 35. 25 ±23. 41， 41. 48 ±25. 00， 46. 23 ±26. 20 days， respectively. The longevity was increased by high-dose EF by 32. 46%（P 0. 01 or P 0. 05） . The old drosophila displayed up-regulation of respiratory chain related enzymes， proteases， pro-apoptotic genes by 2-fold or more. While enzymes responsible for removal of oxygen free radicals， anti-apoptotic genes， endocrine and immunity related genes were down- regulated by 2-fold or more. After treatment by EF， respiratory chain related enzymes and proteolysis enzymes were decreased and enzymes responsible for removal of oxygen free radicals， cell cycle promoting genes， anti-apoptic genes and immunity related genes were increased. Conclusions Senile drosophila have inherence mechanism of excessive production of free radicals and less decreased removal of it， excessive apoptosis， proteolysis and deficiency of immunity. EF can decrease production and increase removal of free radicals， promote cell prolifera- tion， recover immune function and withstand apoptosis to achieve senescence-delaying efficacy. 【Key words】 Epimedium flavonoids；Senescence；Gene expression profiling；Oxygen free radicals；Drosophila 1 中国科学院上海生命科学院神经科学研究所 作者简介： 沈自尹 （1928-） ， 男， 教授， 中国科学院院士， 从事中医 “证” 本 质及延缓衰老研究。 我们研究发现淫羊藿总黄酮 （EF） 能重塑老年大鼠 T 淋巴 细胞凋亡相关基因的平衡而延缓免疫衰老 1； 激活下丘脑的众 多神经递质， 通过 HPAT 轴的下行通路上调老年大鼠衰退的生 长激素轴、 性腺轴、 免疫功能， 表现出延缓神经内分泌免疫衰老 的功效 2， 进而在细胞模型中观察到 EF 能显著延长人二倍体 成纤维细胞的传代次数和延缓其端粒缩短 3。本研究在生物 整体水平研究 EF 对果蝇寿命的影响， 并用基因表达谱探索 EF 延缓衰老的分子机制。 1 资料与方法 1. 1 果蝇 选用野生型柏林种黑腹果蝇 （Drosophila melanol- gaster） ， 在 25、 相对湿度 40% 条件下培养， 果蝇按照 14： 10 h 的明暗周期于每日晨 7 点果蝇接受日光照明， 选用德国维尔兹 堡食物配方饲养。实验分为四组： 老年对照组、 维生素 E 组 （Vit E 组； 1%， 每百克培养基含 VitE 1 mg） 、 EF 低剂量组 （1%， 每百克培养基含 EF 1 mg） 、 EF 高剂量组 （4%， 每百克培养基含 EF 4 mg） ， 每组 200 只果蝇。 1. 2 药物 EF 采用辽宁产朝鲜淫羊藿， 由上海市医药工业研 究院中药室提取。 1. 3 果蝇寿命实验 收集羽化 8 h 的成虫， 5% 二氧化碳麻 醉， 放大镜下鉴别雌雄后， 选取雄性果蝇。药物均加入培养基 中， 果蝇自由取食。各组果蝇每周换培养基两次， 并计数死亡 只数， 实验至果蝇全部死亡结束。计算各组果蝇平均寿命、 最 高寿命。 1. 4 基因表达谱检测 果蝇喂养及药物剂量同果蝇寿命实 验， 不计算死亡只数， 在实验第 50 天时， 收集每组存活果蝇 120 只。并另取孵育后 1 d 的果蝇 120 只作为青年对照组。用 TR- Izol reagent（Invitrogen） 提取总 RNA， 用 RNeasy Mini Kit 纯化总 RNA （QIAGEN） ， 取 5 16 µg 总 RNA 用 Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit 进行 1 st cDNA 的合成， Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit 进行 2 nd cDNA 的合成， 用 GeneChip IVT Labeling Kit） 进行 IVT 合成 cRNA， 片段化 cRNA， 取 15 µg 片断 化 cRNA 与美国 Affymetrix 公司果蝇芯片 GeneChip （r）Drosoph- ila Genome 2. 0 Array 杂交。洗涤、 扫描等过程遵守 Affymetrix ·1601·沈自尹等 淫羊藿总黄酮延长果蝇寿命及其分子机制 第 9 期 公司基因表达操作程序。基因表达数据分析采用 Affymetrix 公 司 GCOS 软件， 基因差异表达 （上调或下调） 2 倍以上为有意 义。基因功能分析采用 Affymetrix 网上分析系统 （ http： / / www. affymetrix. com/ analysis/ index. affx） 。 1. 5 统计学方法 用 SPSS 12. 0 软件， 采用单因素方差分析。 2 结 果 2. 1 寿命实验 与空白对照组比较， 高、 低剂量 EF 均显著延 长果蝇的平均寿命和最高寿命 （P 0. 05） ， EF 延长果蝇寿命显 示一定程度的量效关系， 高剂量组效果更为明显， 提高寿命百 分率为 32. 46% （表 1） 。我们将全程果蝇生存情况作存活果蝇 只数和喂养时间的曲线， 显示自喂养 EF 10 d 左右， 两个 EF 组 存活果蝇只数明显多于空白对照组和 VE 组， 提示 EF 延缓衰 老在果蝇的青年时期即开始 （图 1） 。 2. 2 基因表达谱结果 2. 2. 1 基因表达特征 老年果蝇上调的基因有 1 592 个， 下 调的有1 197 个， 利用 Affymetrix 公司的网上分析系统对差异表 达基因进行功能分析， 老年果蝇的基因表达呈现规律如下： 呼吸链相关的多种氧化还原酶上调， 而自由基清除酶类表达下 调， 如 cytochrome P450-4d1、 6a8、 4p1 及 NAD- dependent methyl- enetetrahydrofolate dehydrogenase 这些细胞呼吸链复合体成分均 上调； 而三个主要的自由基清除酶类如 Mn-SOD、 Cu-Zn-SOD 下 调； 多种蛋白分解酶表达上调； 促凋亡基因上调如具有 caspase 活性的 dream 基因上调， 而抗凋亡基因如基质金属蛋白 酶 1 下调； 内分泌免疫相关的基因下调， 如生长激素受体基 因、 胰岛素样生长因子 1 受体基因、 参与 Toll 受体信号转导的 免疫诱导分子 3 （immune induced molecule 3）（表 2） 。 图 1 果蝇存活只数-喂养时间曲线 表 1 EF 延长果蝇的平均寿命和最高寿命 （x ±s） 组别n 平均寿命 （d） 提高寿命 百分比 （%） 最高寿命 （d） 空白对照组20034. 90 ±23. 041） 2）84 VE 组20035. 25 ±23. 411） 2）84 EF 低剂量组20041. 48 ±25. 0018. 8584 EF 高剂量组20046. 23 ±26. 2032. 4690 与 EF 低剂量组比较： 1） P 0. 05， 与 EF 高剂量组比较： 2） P 0. 01 表 2 老年果蝇基因表达特征 探针代码基因名或基因标志符探针代码基因名或基因标志符探针代码基因名或基因标志符 呼吸链相关酶类上调 2 倍以上蛋白降解酶类上调 2 倍以上1629930-s-atCPCT4） 1623866-atCyp4ac21624092-atJonah 99Ci1630278-s-atSpinster 1624101-atCyp6a231625467-atCG58601640838-s-atAkap200 1629875-a-atCytochrome P450-4d11625436-atUrate oxidase1623189-atPlkk1 1634731-atCyp4p31626093-atJonah65iii1623436-a-atbun 1640755-atCytochrome P450-6a81627119-atCG58601626874-atEip63F-1 1629009-atCyp6a28a51627869-atJonah 25Bi1637053-atCas 1635593-atCyp6d21632790-atDream抗凋亡基因下调 2 倍以上 1635593-atCytochrome P450-4p11629145-atHERC21622984-atSod2 1624939-atCyp6a211630598-atCG181791623160-atMmp1 1640566-atCyp4p21636460-atJonah 65Ai1625761-a-atMmp1 1637871-atCG11423促凋亡基因上调 2 倍以上1627178-atAcp62F 1640775-a-atNmdh1）1623675-atOBP 99b3）内分泌免疫相关基因下调 2 倍以上 自由基清除酶下调 2 倍以上 1630026-s-atDecapentaplegic1622893-atIM3 1622984-atSod2 （Mn）1632790-atDream1639592-atFGF R 1623372Peroxidase1639235-atTartan1624297-atIGF1 R 1623957-s-atGSTS12）1623605-a-atcabut1624344-atGH R 1627840-a-atZipper 表中缩写自行设定 1） NAD-dependent methylenetetrahydrofolate dehydrogenase ； 2） glutathione S transferase S1； 3） Odorant binding protein； 4） CTP： phos- phocholine cytidylytransferase1， 其余遵照 Ayymetrix 注释。 2. 2. 2 EF 对老年果蝇基因表达谱的干预作用 与老年果蝇 组比较， EF 组 101 个基因上调， 有 91 个基因下调， 基因的功能 分析呈现如下规律：（1） 呼吸链相关酶基因下调， 包括两个具 NADH 脱氢酶活性， 在呼吸链中传递电子两个酶 （CG11423， CG15434） 和一个 D + 脱氢酶活性的酶 CG32026， 一个具铁氧还 蛋白-NADP 还原酶活性的基因 CG18335 dare， 而自由基清除酶 基因上调， 如 Cu-Zn SOD 等。 （2） 促进细胞周期的 4 个基因如 CDC23 上调。 （3） 蛋白降解酶下调。 （4） 抗凋亡基因、 免疫相关 ·2601·中国老年学杂志 2005 年 9 月第 25 卷 表 3 EF 对果蝇基因表达的干预 探针代码基因名或基因标志符探针代码基因名或基因标志符探针代码基因名或基因标志符 呼吸链相关酶类上调 2 倍以上1640979-atCG16811628129-a-atSsdic2） 1637871-atCG11423蛋白降解酶上调 2 倍以上1628030-atDynein heavy chain 64c 1640052-atCG154341629098-atCG7631免疫及其他 1624976-atCG32026抗凋亡基因上调 2 倍以上1636380-atDoughnut on 2 1637854-atCG18335 dare1635054-atCG120691629534-atGm-csf 自由基清除酶类上调促进细胞周期基因上调 2 倍以上1634301-atGlutamate receptorIIA 1627955-atCu-zn SOD1636160-atApc1） 1628760-atCG85171636160-atCdc23 表中缩写自行设定者： 1） anaphase-promoting complex； 2） sperm-specfic dynein intermedinate chain. 其余遵照 Ayymetrix 注释。 基因及神经递质受体基因都有上调 （表 3） 。 3 讨 论 抗衰老的根本目的在于尽可能的延长寿命， 并在此基础上 提高生命活力， 故国内外均将细胞和整体寿命试验作为药物延 缓衰老研究的主要检测手段 4。本研究 EF 能显著延长果蝇的 平均寿命， 提高百分率达 32. 46%， 其延长寿命效果优于许多中 药包括复方 4， 也与某些通过基因操作来延长寿命的效果相 当 5， 但与之不同的是， EF 作为一个传统中药的提取物， 没有 改变基因结构的各种风险。 关于衰老形成有多种学说， 自由基损伤学说认为衰老是自 由基对组织随机损害的结果， 体内有呼吸链氧化磷酸化及微粒 体细胞色素 P450 系统在其反应过程中产生自由基， 另外电离 辐射、 紫外照射均可产生超氧阴离子和 H2O2 6。本实验中， 老 年果蝇较青年果蝇多种呼吸链酶表达上调而自由基清除酶类 显著下调， 说明老年状态自由基产生过多而清除能力下降。而 EF 作用之后， 呼吸链酶表达下调而自由基清除酶如 Cu-Zn SOD 上调， 反映 EF 通过调节自由基产生和清除酶的表达发挥抗氧 化作用。中药化学的研究表明， 黄酮类化合物 （包括 EF） 具有 两个苯环， 通过中央三个碳原子连接而成的一类化合物， 大多 在各环都有酚羟基取代， 因此能将氢供给脂类化合物自由基， 能作为一种自由基吸附剂而发挥作用 7。结合我们的研究说 明， 抗氧化作用是 EF 延缓衰老及延长寿命的重要机制， EF 通 过两个途径发挥抗氧化作用， 一是调节自由基生成和清除酶系 的表达， 二是直接与自由基反应而清除体内自由基。 细胞凋亡是机体一个主动调控的细胞死亡过程， 研究表明 过度细胞凋亡是老年个体免疫功能下降、 神经退行性改变、 组 织萎缩等的重要机制 8， 本研究观察到老年果蝇的促凋亡基因 显著上调， 如具有 caspase 活性的 dream 基因， 而抗凋亡基因如 基质金属蛋白酶 1 表达显著下调， 其协同作用的结果反映老年 果蝇存在过度的细胞凋亡。EF 除了上调抗凋亡基因， 其突出效 果还表现在上调多种促细胞周期基因的表达， 细胞通过细胞周 期过程完成细胞数量的增殖。细胞衰老最显著的特征就是细 胞阻滞于 G1 期， 失去对有丝分裂原的反应能力， 不能进入 S 期 9， EF 显著上调四个促细胞周期基因表达， 表明通过促进细 胞增殖， 对抗过度细胞凋亡引起的细胞数目减少， 加强组织的 修复。 研究表明， 衰老时某些蛋白酶的表达过度， 其结果是生理 活性物质的降解和细胞结构的破坏 10， 如具有 caspase 活性酶 类的上调， 导致细胞凋亡。本研究中老年果蝇出现大量蛋白酶 表达上调， EF 作用后， 使蛋白酶基因明显下调， 提示 EF 减轻蛋 白质降解也是其延缓衰老的机制之一。 老年果蝇基因表达谱还揭示了衰老时的其他一些内在机 制， 如内分泌免疫相关基因的下调。但与我们在大鼠 HPAT 轴 进行的基因表达研究比较 2， 本研究老年果蝇或 EF 干预后， 这 类基因数目较少， 可能与果蝇尚不健全的神经内分泌系统有 关， 但 EF 仍然上调神经递质受体谷氨酸受体、 粒细胞-巨嗜细 胞集落刺激因子和参与 Toll （先天性免疫的重要受体家族） 信 号转导的分子的表达， 反映其促进免疫功能。 本研究揭示了果蝇衰老时体内若干重要的内在机制， 如自 由基产生过多而清除减少、 凋亡加速、 蛋白裂解过度、 内分泌免 疫功能低下， 而 EF 通过减少自由基的产生， 增加自由基的清 除， 促进细胞增殖， 恢复免疫、 对抗凋亡而发挥延缓衰老的功 效， 生命活力的提高也是抗衰老的重要目的。EF 对衰老时生命 质量包括学习记忆能力、 抗疲劳能力、 各种行为的改善是值得 进一步研究。 4 参考文献 1 陈 瑜， 沈自尹， 陈伟华 . 淋巴细胞基因表达谱揭示淫羊藿总黄酮重 建衰老免疫稳态的分子机制 J . 中国中西医结合杂志， 2004； 24 （1） ： 58-62. 2 沈自尹， 陈 瑜， 黄建华， 等 . EF 延缓 HPAT 轴衰老的基因表达谱研 究 J . 中国免疫学杂志， 2004； 20 （1） ： 59-62. 3 胡作为， 沈自尹， 黄建华 . 淫羊藿总黄酮保护衰老细胞端粒长度缩短 的实验研究 J . 中国中西医结合杂志， 2004； 24 （12） ： 1094-7. 4 李春生， 侯荣先 . 国内应用寿命试验和衰老动物模型研究抗衰老中 药的近室内概况 J . 中医杂志， 1998； 39 （11） ： 690-3. 5 程春雷， 高天勤 . 胰岛素/ 胰岛素样生长因子-1 信号通路与衰老 J . 国外医学·老年医学分册， 2004； 25： 145-8. 6 景亚武， 易 静， 高 飞， 等 . 活性氧： 从毒性分子到信号分子 活 性氧与细胞的增殖、 分化和凋亡及其信号转导途径 J . 细胞生物学 杂志， 2003； 25 （4） ： 197-202. 7 黄池宝， 罗宗铭， 宾丽英 . 黄酮类化合物抗氧化性与结构关系的研究 J . 广东工业大学学报， 2000； 17 （2） ： 71-4. 8 杨 龙， 黄 英， 张宗玉， 等 . 衰老与凋亡 J . 老年医学与保健， 1999； 5 （2） ： 93-5. 9 赵朝晖 . 细胞周期调控与细胞衰老 J . 老年医学与保健， 2003； 9 （1） ： 55-7. 10 Jiang CH， Tsien JZ， Schultz PG， et al. The effects of aging on gene ex- pression in the hypothalamus and cortex of mice J . Proc Natl Acad Sci USA， 2001； 98 （4） ： 1930-4. 2005-04-04 收稿 2005-07-07 修回 （编辑 牛铁兵） ·3601·沈自尹等 淫羊藿总黄酮延长果蝇寿命及其分子机制 第 9 期