10株猪圆环病毒2型(PCV2)河南株全基因组的克隆与序列分析.pdf
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1、1 6 6 中 国 兽 医 学 报2 0 1 0 年 2 月 第 3 O 卷第 2 期C h i n J V e t S c i F e b 2 0 1 0 V o 1 3 0 N o 2 1 0株猪圆环病毒 2型 ( P CV 2 ) 河南株全基因组的克隆与序列分析 陈 陆, 彭志锋, 杨 霞, 陈圆圆, 王宏魁 , 孙彦婷 , 郑鹿平, 王川庆 ( 河南农业大学 牧医工程学院, 河南 郑 州 4 5 0 0 0 2 ) 摘要 : 为了解猪 圆环病毒 2型 ( P C V2 ) 河 南株 的起 源 及遗传 变异 , 从 河 南省 不同临床 表现 的病猪 中克 隆了 1 O椿 P C V2的全
2、基 因组 , 并对其进行 了序 列测定及分析 。结果表明, 河南株之 间以及与 中国其他地区 P C V 2流行株 之 间 同源性均很高; 河 南株均处于欧洲分支 中, 提示 P C V2河南株 可能起 源于欧洲株 ; 河南省 不同年份的 P C V2中确 实 存在一定的基 1N差异 , 但 P C V2全基因组从 总体上 来说遗传进化相对稳定 ; 河南省猪群 中与 P C V相 关的疾病不是 由 P C V 2变异毒株引起的。 关键词 : 猪 圆环病毒 2型 ; 全基 因组 克隆; 序 列分析 中 图分 类 号 : $ 8 5 2 6 5 文 献 标 识 码 : A 文章 编 号 : 1 0
3、 0 5 4 5 4 5 ( 2 0 1 0 ) 0 2 0 1 6 6 0 8 S e q u e nc e a n a l y s i s o f c o mpl e t e g e n o me o f t e n p o r c i n e c i r c o v i r u s t y p e 2 s t r a i ns i n He n a n p r o v i n c e CHEN Lu , PENG Z h i f e n g 厶, YANG Xi a , CHEN Yu a n y u a n, W ANG Ho n g k u i , S UN Ya n t i n g
4、, Z HE NG L u p i n g , WANG C h u a n q i n g ( C o l l e g e o f An i ma l Hu s b a n d r y a n d V e t e r i n a r y, He n a n Agr i c u l t ur al Uni ve r s i t y, Zh e n gz ho u 4 5 0 00 2, Chi n a) Ab s t r a c t : To un de r s t a n d t he ge n e t i c he t e r o ge n e i t y a n d t h e o r
5、i gi n of PCV2 s t r a i ns i n He n a n p r o vi ne ,c omp l e t e g e n o me s o f 1 0 P CV2 s t r a i n s we r e c l o n e d a n d a n a l y s e d f r o m t h e s wi n e s wi t h V a r i o u s c l i n i e a l ma n i e s t a t i o n i n He n a n pr o vi nc e The r e s u l t i n di c a t e d t h a
6、t t he PCV2 s t r a i ns i n He na n wr e c l os e l y r e l a t e d t O e a c h o t he r , bu t a l s o t O PCV2 s t r a i n s f r om ot h er a r e a s o f Ch i n a The PCV2 s t r a i ns i n H e n a n we r e i n c l u de d i n t he Eur op e c l u s t e r I t wou l d be c on c l ue d t ha t t h e PC
7、V2 s t r a i ns i n He n a n ma y o r i gi na t e f r o m Eu r op e PCV2 Al t h ou gh mi no r g e ne t i c di f f e r e nc es a mon g P CV2 s t r a i n s i n d i f f e r e n t y e a r s , t h e g e n o me o f P CV2 s t r a i n s i n He n a n p r o v i n c e e x h i b i t e d a q u i t e s t a b l e
8、g e n e t i c h o rn o ge n e i t y The po r c i ne c i r c ov i r u s a s s oc i a t e d d i s e a s e i n H e n a n pr ov i nc e i s mos t l i ke l y n o t du e t o t h e e me r g e nc e of a ne w ge n o t y p e of PCV2 Ke y wo r ds : p or c i ne c i r c ovi r us t y pe 2( PCV2); c ompl et e ge n
9、o me c l o ni n g; s e qu e n c e a na l ys i s Jo i n t fi r s t a u t h o r s ; * C 0 r r P s 户 。 g a u t h o r , E - ma i l : wc h u a n q s o h u c o rn 猪 圆环 病 毒 ( P VC) 是 小 的无 囊 膜 单 链 环 状 D NA病 毒 , 属 于 圆环病 毒科 圆环病 毒属u 。根 据病 毒 的抗 原性 和基 因组成 的不 同分为 P C V1和 P C V2 两个血 清 型 。其 中 ,P C V1对 猪 无 致 病 作 用 ,
10、 在 很多国家猪群 中广泛存在 ; P C V2具有致 病性。 。 j 。 自 1 9 9 6年 Ha r d i n g等 证 实 P C V2与 P MWS的 发生有 关 以来 , 世 界各 地 的 研 究者 相 继 从不 同临 床 表现 的病例 中分 离 出 P C V2 , 包 括 猪 繁 殖 障 碍 ( Re 一 收稿 日期 : 2 0 0 8 1 2 3 0 基金项 目: 国家科技支撑计划资助项 目( 2 6 B A KO 2 A2 1 3 ) ; 国 家“ 8 6 3 ” 计划资助项 目( 2 0 0 7 AA1 0 0 6 0 6 ) 作者简介 : 彭志锋( 1 9 8 2 一
11、 ) , 男 , 在读硕士 。 *通讯作者, E ma i l : wc h u a n q s o h u c o m 同为第 1作者 p r o d u c t i v e d i s o r d e r s ) , 猪 皮 炎 与 肾病 综 合 征 P o r c i n e de r ma t i t i s a nd n e ph r op a t hy s y ndr o me, P DNS ) , 仔 猪 先 天 性 震 颤 ( C o n g e n i t a l t r e mo r , C T) 等 , 这一系列临床表现统称为猪圆环病毒相关疾病 ( P o r c i n
12、 e c i r c O v i r u s a s s o e i a t e d d i s e a s e , PC VAD) 。 此外 , 在无 P C V AD临床症状和病理变化 的猪群 中 也分 离 到 P C V2 , 提 示 P C V2存 在 亚 临 床感 染 或 者 不同毒株的致病力有差异 。回顾性血清学调查表 明 , 在 P MWS病 例 报 道 之 前 已 经 存 在 P C V2感 染 s 。 。这些研究表 明, P C V2并不是一种新病毒 , 猪群 中 P C V2感染率 远远高于 P MWS的发病率。 所以在更 大范 围内, 从 不 同临床病 例 中分离 鉴 定
13、 P C V2并 对其 遗传 变异规 律及 可 能 出现 的变 异 株进 行研 究 , 对于 理解 P C V2的致 病 机理 及制 定 相 应 的 中 国 兽 医 学 报2 0 1 0 年 2 月 第 3 0 卷第 2 期C h i n J V e t S c i F e b 2 0 1 0 V o 1 3 0 N o 2 1 6 7 防制措施至关重要。为 了解河南省 P C V2的起 源 及遗传变异 , 以便提 出 P C VAD的科学合理 的防制 措 施 , 我 们 从河 南 省 2 0 0 7 2 0 0 8年 呈 现 不 同 临 床 表 现的病 例 中 克 隆 了 l O株 P C
14、V2的 全 基 因组 , 并 对其进行了序列测定和分析。 1 材料 与方法 1 1 病料本研究中所用病料包括脾脏 、 淋巴结和 肺脏分别采 自2 0 0 7年 8月至 2 0 0 8年 3月河南省 l O 个地 区的 1 O份 P C V2阳性病料 。病例呈现不同l 临 床 表 现 , 详 情见 表 1 。 1 2载 体 、 菌种 及 主 要 试 剂p MD1 8 一 T v e c t o r 试 剂 盒 、 菌 株 J Ml O 9 、 T a q D NA 聚 合 酶 、 Hi n d I I I 和 Kp n I内切 酶 均为 Ta K a Ra 公 司产 品 。 表 1 l O株 P
15、 C V2 相 应病例的发生地及 临床 史和 日龄 毒株名称 流行地l临床史 日龄 周 毒株名称 流行地 临床史 日龄 周 N a n y a n g - C N 0 7 南阳 猪瘟 7 Ka i f e n g C N 一 0 8 开封 猪瘟 4 8 P i n g d i n g s h a n -C N 0 7平顶 山 皮 炎与 肾病综合征 3 6 L u o y a n g C N 一 0 8 洛 阳 仔猪先天性震颤 3 5 Z h u ma d ia n C N一 0 7 驻马店 仔猪断奶后多系统衰竭综合征 7 J i a o z u o C N一 0 8 焦作 仔猪断奶后多系统衰竭
16、综 合征 6 7 Z h o u k o u C N一 0 8 周 口 猪瘟 6 Z h e n g z h o u CN 0 8 郑州 神经症状 5 L u o h m C N 0 7 漯河 仔猪断奶后多系统衰竭综合征 5 7 Xin x i a n g CN 一 0 7 新乡 仔猪断奶后多系统衰竭综合 征 5 7 1 。 3 P C V 2全基 因 组 的抽 提用 P C R 方 法 鉴定 为 P C V2阳性 的病 料 ( 脾脏 、 淋 巴结 和 肺脏 ) , 参 照 文献 8 抽 提 P C V2的全基 因组 。 1 4引物的 设计 与合 成 参 考 Ge n B a n k中 P C
17、 V 2 序 列 ( AY6 9 6 0 0 4 ) 设 计 了 1对 背 对 背 引 物 P 1 P 2 , P1: 5 一 TTTCCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGA AAGT一 3 ;P2:5 一 AGCCCGCGGAAATTTCTGA C A AA C GTT AC A 一3 。P 1和 P 2的 5 均 引入 了 S a c I I 酶切 位点 ( 划线 部 分 ) , 引物 由上 海生 物 工程 技 术 公 司合成 。 1 5 P C V2全 基 因 组 的 P C R 扩 增 反 应 体 系 d d H2 O 2 8 5 “ L,1 0 ( M g 一 )B u f f
18、 e r 5 u I , Mg CL 2 ( 2 5 mmo l L)5 u L, d NTP( 1 0 mmo l L)1 L, 上 、 下游 引物 ( 2 Oa mo l L ) 各 1 L, 模板 DNA 8 L, E x Ta q DNA 聚合 酶 ( 5 U L ) 0 5 L。P C R反 应 程序 : 9 5。 C预 变性 5 mi n , 然后 9 4。 C 1 mi n , 5 5 1 mi n , 7 2 2 mi n , 3 0个循 环后 , 7 2。C延 伸 1 0 rai n 。 扩增 产物 经 1 琼 脂糖 凝 胶 电泳 后 , 在 凝 胶 成 像 系 统 中观察
19、结果 。 1 6 P C V 2全 基 因组 的 克 隆 和 重 组 质 粒 鉴 定 用 胶 回收试 剂盒 纯化 P C V2全基 因组 , 按 照 p MD 1 8 一 T Ve c t o r 试剂 盒说 明 书将 回收 的基 因 片段 与 p MD1 8 一 T载 体 连 接 , 转 化 感 受 态 细 胞 J Ml O 9 , 而 后 进 行 P C R及 Hi n d H I 和 Kp n I双 酶切 鉴定 。 表 2 本研 究中进行进化 分析 所选用的其他地 区的 P C V 2毒株 登 录号 分离株名杯 流仃地 长度 b p 登录号 分离株名称 流行地 长度 b p AF 0 5
20、 5 3 9 1 P CVU一 9 8 美国 7 6 8 AY 5 5 6 4 7 7 Hu n a n 一 0 4 湖南 1 7 6 7 AFl 1 7 7 5 3 P C V2 D - 9 9 加拿大 7 6 8 D Q9 l 0 8 6 5 B D 1 A一 0 6 河北 1 7 6 7 AF 5 3 8 3 2 5 E d H1 3 -0 2 北 京 1 7 6 7 AY5 5 6 4 7 3 S 【 ) I O 4 山东 1 7 6 7 AF 2 0 1 3 0 6 GR E 2 9 9 德国 l 7 6 8 AY2 9 1 3 1 6 Q【 ) I O 3 青岛 1 7 6 7 E
21、 Ul 4 8 5 0 6 D Kl 9 9 3 丹麦 l 7 6 8 AY5 5 6 4 7 5 GX 0 4 广西 1 7 6 7 AF 4 5 4 5 4 6 KS Y一 0 1 韩国 1 7 6 8 E F 6 7 5 2 3 7 GX GW 0 7 广西 1 7 6 7 AB 0 7 2 3 0 1 No 3 3 0 1 日本 l 7 6 8 AY5 5 6 4 7 6 Ha i n a n 一 0 4 海 南 1 7 6 7 E F 5 2 4 5 4 2 HB 0 6 0 4 河北 1 7 6 8 AY6 1 3 8 5 4 GI ) _ O 4 广东 1 7 6 7 AY5 5
22、 6 4 7 4 F J 0 4 福建 1 7 6 8 D QO 1 7 0 3 6 GD - Z J 一 0 5 广东 1 7 6 7 AY1 4 6 9 9 2 P in g t u n g 一 0 2 中国台湾 l 7 6 7 AY6 9 6 0 0 4 He n a n 一 0 5 河南 1 7 6 7 AF 3 6 4 0 9 4 C h i a Y i 0 1 中国台湾 l 7 6 7 AY7 3 2 4 9 4 J XI I 一 0 4 江西 1 7 6 7 E U1 4 8 5 0 7 D K 9 6 丹 麦 1 7 6 6 AY6 8 6 7 6 3 S H 0 4 上 海
23、1 7 6 7 AY3 2 1 9 8 2 F h l 4 0 3 法 国 1 7 6 7 AY6 9 1 6 7 9 J S _ 0 4 江苏 1 7 6 7 AJ 2 9 3 8 6 9 I mp 1 1 4 7 - 0 0 英国 1 7 6 6 AY2 9 l 3 l 7 HB _ 0 3 湖北 1 7 6 7 DQ1 9 5 6 7 9 Z J - o 5 浙 江 1 7 6 7 AY2 1 7 7 4 3 HZ 0 2 0 2 浙 江 1 7 6 7 E F 2 】 O 】 O 6 Z J o 6 浙i 工 】7 6 7 DQ9 1 5 5 8 7 GRE 一 3 0 6 英国 1
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