10株猪圆环病毒2型（PCV2）河南株全基因组的克隆与序列分析.pdf

1 6 6 中 国 兽 医 学 报2 0 1 0 年 2 月 第 3 O 卷第 2 期C h i n J V e t S c i F e b 2 0 1 0 V o 1 3 0 N o 2 1 0株猪圆环病毒 2型 ( P CV 2 ) 河南株全基因组的克隆与序列分析 陈 陆， 彭志锋， 杨 霞， 陈圆圆， 王宏魁 ， 孙彦婷 ， 郑鹿平， 王川庆 ( 河南农业大学 牧医工程学院， 河南 郑 州 4 5 0 0 0 2 ) 摘要 ： 为了解猪 圆环病毒 2型 ( P C V2 ) 河 南株 的起 源 及遗传 变异 ， 从 河 南省 不同临床 表现 的病猪 中克 隆了 1 O椿 P C V2的全基 因组 ， 并对其进行 了序 列测定及分析 。结果表明， 河南株之 间以及与 中国其他地区 P C V 2流行株 之 间 同源性均很高； 河 南株均处于欧洲分支 中， 提示 P C V2河南株 可能起 源于欧洲株 ； 河南省 不同年份的 P C V2中确 实 存在一定的基 1N差异 ， 但 P C V2全基因组从 总体上 来说遗传进化相对稳定 ； 河南省猪群 中与 P C V相 关的疾病不是 由 P C V 2变异毒株引起的。 关键词 ： 猪 圆环病毒 2型 ； 全基 因组 克隆； 序 列分析 中 图分 类 号 ： $ 8 5 2 6 5 文 献 标 识 码 ： A 文章 编 号 ： 1 0 0 5 4 5 4 5 ( 2 0 1 0 ) 0 2 0 1 6 6 0 8 S e q u e nc e a n a l y s i s o f c o mpl e t e g e n o me o f t e n p o r c i n e c i r c o v i r u s t y p e 2 s t r a i ns i n He n a n p r o v i n c e CHEN Lu ， PENG Z h i f e n g 厶， YANG Xi a ， CHEN Yu a n y u a n， W ANG Ho n g k u i ， S UN Ya n t i n g， Z HE NG L u p i n g ， WANG C h u a n q i n g ( C o l l e g e o f An i ma l Hu s b a n d r y a n d V e t e r i n a r y， He n a n Agr i c u l t ur al Uni ve r s i t y， Zh e n gz ho u 4 5 0 00 2， Chi n a) Ab s t r a c t ： To un de r s t a n d t he ge n e t i c he t e r o ge n e i t y a n d t h e o r i gi n of PCV2 s t r a i ns i n He n a n p r o vi ne ，c omp l e t e g e n o me s o f 1 0 P CV2 s t r a i n s we r e c l o n e d a n d a n a l y s e d f r o m t h e s wi n e s wi t h V a r i o u s c l i n i e a l ma n i e s t a t i o n i n He n a n pr o vi nc e The r e s u l t i n di c a t e d t h a t t he PCV2 s t r a i ns i n He na n wr e c l os e l y r e l a t e d t O e a c h o t he r ， bu t a l s o t O PCV2 s t r a i n s f r om ot h er a r e a s o f Ch i n a The PCV2 s t r a i ns i n H e n a n we r e i n c l u de d i n t he Eur op e c l u s t e r I t wou l d be c on c l ue d t ha t t h e PCV2 s t r a i ns i n He n a n ma y o r i gi na t e f r o m Eu r op e PCV2 Al t h ou gh mi no r g e ne t i c di f f e r e nc es a mon g P CV2 s t r a i n s i n d i f f e r e n t y e a r s ， t h e g e n o me o f P CV2 s t r a i n s i n He n a n p r o v i n c e e x h i b i t e d a q u i t e s t a b l e g e n e t i c h o rn o ge n e i t y The po r c i ne c i r c ov i r u s a s s oc i a t e d d i s e a s e i n H e n a n pr ov i nc e i s mos t l i ke l y n o t du e t o t h e e me r g e nc e of a ne w ge n o t y p e of PCV2 Ke y wo r ds ： p or c i ne c i r c ovi r us t y pe 2( PCV2)； c ompl et e ge n o me c l o ni n g； s e qu e n c e a na l ys i s Jo i n t fi r s t a u t h o r s ； * C 0 r r P s 户 。 g a u t h o r ， E - ma i l ： wc h u a n q s o h u c o rn 猪 圆环 病 毒 ( P VC) 是 小 的无 囊 膜 单 链 环 状 D NA病 毒 ， 属 于 圆环病 毒科 圆环病 毒属u 。根 据病 毒 的抗 原性 和基 因组成 的不 同分为 P C V1和 P C V2 两个血 清 型 。其 中 ，P C V1对 猪 无 致 病 作 用 ， 在 很多国家猪群 中广泛存在 ； P C V2具有致 病性。 。 j 。 自 1 9 9 6年 Ha r d i n g等 证 实 P C V2与 P MWS的 发生有 关 以来 ， 世 界各 地 的 研 究者 相 继 从不 同临 床 表现 的病例 中分 离 出 P C V2 ， 包 括 猪 繁 殖 障 碍 ( Re 一 收稿 日期 ： 2 0 0 8 1 2 3 0 基金项 目： 国家科技支撑计划资助项 目( 2 6 B A KO 2 A2 1 3 ) ； 国 家“ 8 6 3 ” 计划资助项 目( 2 0 0 7 AA1 0 0 6 0 6 ) 作者简介 ： 彭志锋( 1 9 8 2 一 ) ， 男 ， 在读硕士 。 *通讯作者， E ma i l ： wc h u a n q s o h u c o m 同为第 1作者 p r o d u c t i v e d i s o r d e r s ) ， 猪 皮 炎 与 肾病 综 合 征 P o r c i n e de r ma t i t i s a nd n e ph r op a t hy s y ndr o me， P DNS ) ， 仔 猪 先 天 性 震 颤 ( C o n g e n i t a l t r e mo r ， C T) 等 ， 这一系列临床表现统称为猪圆环病毒相关疾病 ( P o r c i n e c i r c O v i r u s a s s o e i a t e d d i s e a s e ， PC VAD) 。 此外 ， 在无 P C V AD临床症状和病理变化 的猪群 中 也分 离 到 P C V2 ， 提 示 P C V2存 在 亚 临 床感 染 或 者 不同毒株的致病力有差异 。回顾性血清学调查表 明 ， 在 P MWS病 例 报 道 之 前 已 经 存 在 P C V2感 染¨ s 。 。这些研究表 明， P C V2并不是一种新病毒 ， 猪群 中 P C V2感染率 远远高于 P MWS的发病率。 所以在更 大范 围内， 从 不 同临床病 例 中分离 鉴 定 P C V2并 对其 遗传 变异规 律及 可 能 出现 的变 异 株进 行研 究 ， 对于 理解 P C V2的致 病 机理 及制 定 相 应 的 中 国 兽 医 学 报2 0 1 0 年 2 月 第 3 0 卷第 2 期C h i n J V e t S c i F e b 2 0 1 0 V o 1 3 0 N o 2 1 6 7 防制措施至关重要。为 了解河南省 P C V2的起 源 及遗传变异 ， 以便提 出 P C VAD的科学合理 的防制 措 施 ， 我 们 从河 南 省 2 0 0 7 2 0 0 8年 呈 现 不 同 临 床 表 现的病 例 中 克 隆 了 l O株 P C V2的 全 基 因组 ， 并 对其进行了序列测定和分析。 1 材料 与方法 1 1 病料本研究中所用病料包括脾脏 、 淋巴结和 肺脏分别采 自2 0 0 7年 8月至 2 0 0 8年 3月河南省 l O 个地 区的 1 O份 P C V2阳性病料 。病例呈现不同l 临 床 表 现 ， 详 情见 表 1 。 1 2载 体 、 菌种 及 主 要 试 剂p MD1 8 一 T v e c t o r 试 剂 盒 、 菌 株 J Ml O 9 、 T a q D NA 聚 合 酶 、 Hi n d I I I 和 Kp n I内切 酶 均为 Ta K a Ra 公 司产 品 。 表 1 l O株 P C V2 相 应病例的发生地及 临床 史和 日龄 毒株名称 流行地l临床史 日龄 周 毒株名称 流行地 临床史 日龄 周 N a n y a n g - C N 0 7 南阳 猪瘟 7 Ka i f e n g C N 一 0 8 开封 猪瘟 4 8 P i n g d i n g s h a n -C N 0 7平顶 山 皮 炎与 肾病综合征 3 6 L u o y a n g C N 一 0 8 洛 阳 仔猪先天性震颤 3 5 Z h u ma d ia n C N一 0 7 驻马店 仔猪断奶后多系统衰竭综合征 7 J i a o z u o C N一 0 8 焦作 仔猪断奶后多系统衰竭综 合征 6 7 Z h o u k o u C N一 0 8 周 口 猪瘟 6 Z h e n g z h o u CN 0 8 郑州 神经症状 5 L u o h m C N 0 7 漯河 仔猪断奶后多系统衰竭综合征 5 7 Xin x i a n g CN 一 0 7 新乡 仔猪断奶后多系统衰竭综合 征 5 7 1 。 3 P C V 2全基 因 组 的抽 提用 P C R 方 法 鉴定 为 P C V2阳性 的病 料 ( 脾脏 、 淋 巴结 和 肺脏 ) ， 参 照 文献 8 抽 提 P C V2的全基 因组 。 1 4引物的 设计 与合 成 参 考 Ge n B a n k中 P C V 2 序 列 ( AY6 9 6 0 0 4 ) 设 计 了 1对 背 对 背 引 物 P 1 P 2 ， P1： 5 一 TTTCCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGA AAGT一 3 ；P2：5 一 AGCCCGCGGAAATTTCTGA C A AA C GTT AC A 一3 。P 1和 P 2的 5 均 引入 了 S a c I I 酶切 位点 ( 划线 部 分 ) ， 引物 由上 海生 物 工程 技 术 公 司合成 。 1 5 P C V2全 基 因 组 的 P C R 扩 增 反 应 体 系 d d H2 O 2 8 5 “ L，1 0× ( M g 一 )B u f f e r 5 u I ， Mg CL 2 ( 2 5 mmo l L)5 u L， d NTP( 1 0 mmo l L)1 L， 上 、 下游 引物 ( 2 Oa mo l L ) 各 1 L， 模板 DNA 8 L， E x Ta q DNA 聚合 酶 ( 5 U L ) 0 5 L。P C R反 应 程序 ： 9 5。 C预 变性 5 mi n ， 然后 9 4。 C 1 mi n ， 5 5 1 mi n ， 7 2 2 mi n ， 3 0个循 环后 ， 7 2。C延 伸 1 0 rai n 。 扩增 产物 经 1 琼 脂糖 凝 胶 电泳 后 ， 在 凝 胶 成 像 系 统 中观察 结果 。 1 6 P C V 2全 基 因组 的 克 隆 和 重 组 质 粒 鉴 定 用 胶 回收试 剂盒 纯化 P C V2全基 因组 ， 按 照 p MD 1 8 一 T Ve c t o r 试剂 盒说 明 书将 回收 的基 因 片段 与 p MD1 8 一 T载 体 连 接 ， 转 化 感 受 态 细 胞 J Ml O 9 ， 而 后 进 行 P C R及 Hi n d H I 和 Kp n I双 酶切 鉴定 。 表 2 本研 究中进行进化 分析 所选用的其他地 区的 P C V 2毒株 登 录号 分离株名杯 流仃地 长度 b p 登录号 分离株名称 流行地 长度 b p AF 0 5 5 3 9 1 P CVU一 9 8 美国 7 6 8 AY 5 5 6 4 7 7 Hu n a n 一 0 4 湖南 1 7 6 7 AFl 1 7 7 5 3 P C V2 D - 9 9 加拿大 7 6 8 D Q9 l 0 8 6 5 B D 1 A一 0 6 河北 1 7 6 7 AF 5 3 8 3 2 5 E d H1 3 -0 2 北 京 1 7 6 7 AY5 5 6 4 7 3 S 【 ) I O 4 山东 1 7 6 7 AF 2 0 1 3 0 6 GR E 2 9 9 德国 l 7 6 8 AY2 9 1 3 1 6 Q【 ) I O 3 青岛 1 7 6 7 E Ul 4 8 5 0 6 D Kl 9 9 3 丹麦 l 7 6 8 AY5 5 6 4 7 5 GX 0 4 广西 1 7 6 7 AF 4 5 4 5 4 6 KS Y一 0 1 韩国 1 7 6 8 E F 6 7 5 2 3 7 GX GW 0 7 广西 1 7 6 7 AB 0 7 2 3 0 1 No 3 3 0 1 日本 l 7 6 8 AY5 5 6 4 7 6 Ha i n a n 一 0 4 海 南 1 7 6 7 E F 5 2 4 5 4 2 HB 0 6 0 4 河北 1 7 6 8 AY6 1 3 8 5 4 GI ) _ O 4 广东 1 7 6 7 AY5 5 6 4 7 4 F J 0 4 福建 1 7 6 8 D QO 1 7 0 3 6 GD - Z J 一 0 5 广东 1 7 6 7 AY1 4 6 9 9 2 P in g t u n g 一 0 2 中国台湾 l 7 6 7 AY6 9 6 0 0 4 He n a n 一 0 5 河南 1 7 6 7 AF 3 6 4 0 9 4 C h i a Y i 0 1 中国台湾 l 7 6 7 AY7 3 2 4 9 4 J XI I 一 0 4 江西 1 7 6 7 E U1 4 8 5 0 7 D K 9 6 丹 麦 1 7 6 6 AY6 8 6 7 6 3 S H 0 4 上 海 1 7 6 7 AY3 2 1 9 8 2 F h l 4 0 3 法 国 1 7 6 7 AY6 9 1 6 7 9 J S _ 0 4 江苏 1 7 6 7 AJ 2 9 3 8 6 9 I mp 1 1 4 7 - 0 0 英国 1 7 6 6 AY2 9 l 3 l 7 HB _ 0 3 湖北 1 7 6 7 DQ1 9 5 6 7 9 Z J - o 5 浙 江 1 7 6 7 AY2 1 7 7 4 3 HZ 0 2 0 2 浙 江 1 7 6 7 E F 2 】 O 】 O 6 Z J o 6 浙i 工 】7 6 7 DQ9 1 5 5 8 7 GRE 一 3 0 6 英国 1 7 6 7 AY6 8 6 7 6 4 Z J 一 0 4 浙江 1 7 6 7 AY0 9 4 6 1 9 P C V2 0 3 美国 1 7 6 8 AF 0 2 7 2 1 7 C A P CV 一 9 7 加 拿 大 1 7 6 8 E F 5 9 2 5 7 5 HI J 2 0 7 黑 龙 江 1 7 6 7 AF 0 5 5 3 9 4 F R 9 8 英国 1 7 6 7 E F 5 5 9 4 1 P C V1 一 O 7 杭州 1 7 5 9 AF 3 8 l 1 7 5 B F - 0 1 中 国 1 7 6 8 U4 9 1 8 6 P C V1 9 6 英 国 1 7 5 9 E F 0 6 4 1 4 9 KF 一 0 6 河南开封 7 0 2 E F 4 6 7 9 2 8 HX O 7 河南安 阳 7 0 2 E F 0 6 4 1 5 0 Z MD - 0 6 河南驻马店 7 0 2 E F 0 2 8 2 0 2 J z O 6 河南焦作 7 O 2 注 ： P C V2 一 ORF 2的序列登 录号用 *做 了标注 1 6 8 中 国 兽 医 学 报2 0 1 0 年 2 月 第 3 O 卷第 2 期C h i n J V e t S c i F e b 2 0 1 0 V o 1 3 0 N o 2 1 7 P C V 2全 基因组 的序 列测 定和分 析 将鉴 定 后 的 阳性 重组 质粒送 上海 生物 工程 技 术公 司测序 。测 定 的序列用 B l a s t 软件 比对 分 析 确 定 为 P C V2全 基 因组 后 ， 以 从 Ge n B a n k中 选 取 的 P C V2序 列 作 参 考 ， 详情见 表 2 。用 D NAS t a r 进 行 P C V2 全 基 因组 、 P C V2 一 O RF 1 、 P C V2 一 OR F 2和 P C V2 0R F 3的 核 苷 酸 、 氨基酸 同源性分 析 。 并对 C a p蛋 白和 OR F 3蛋 白 进行抗原性分析 ； 用 C l u s t a l x ( 1 8 )进行 P C V2全 基 因 组 序 列 比对 。 使 用 B o o t s t r a p p e d Ne i g h b o r J o i n i n g算 法生成 系统进 化树 。 2 结果 2 1 P C 2全 基 因组 的 P C R 扩增 以从 河 南 省南 阳、 郑州采 集的病料 抽提 的 D NA 为模 板， 用 引物 p l p 2扩增 的产物经 1 9 6 琼脂糖凝胶电泳检测 ， 结果 见 图 1 。由图可 以看 出 ， P C R扩增 产物 长度约 为 1 7 k b ， 与预期相符。其他来源的 P C V2河南株 的全基 因组扩增 产物 也与预 期一 致 ， 电泳 图略 。 2 0 0 0 1 0 0 0 7 5 0 5 0 0 2 0 0 1 0 0 图 1 P C V 2全基因组的 P C R扩增 产物 M D I 2 O 0 0 Ma r k e r ； 1 阳性对照 ； 2 郑州株 P C R产物 ； 3 南 阳株 P C R产 物 ； 4 阴性 对照 2 2重组 质粒 的 鉴 定及 序 列测 定 用 Hi n d 和 Kp n I双 酶切及 P C R方法 对 P C V2河 南南 阳株重 组 质 粒进行 鉴定 ， 结 果见 图 2 。P C V2河南 南 阳株重 组 质粒 的双 酶 切 及 P C R 扩 增 结 果 与 预 期 相 符 ， 其 他 P C V2河南 株的重 组质粒 鉴 定 电泳 图从 略 。1 O株 河 南 P C V2分离 株( 平顶 山 、 南 阳 、 漯 河 、 驻 马店 、 新 乡 、 周 口、 焦 作 、 开 封 、 洛 阳 、 郑 州 ) 的 测 序 结 果 已登 录 Ge n B a n k ， 登 录 号 分 别 为 E U4 1 8 6 2 6 ， E U4 1 8 6 2 7 ， EU5 21 7 0 7， EU 5 2 l 7 08， EU52 l 7 0 9， EU6 5 6l 4 3， EU 7 8 0 07 3， EU78 0 0 7 4， EU5 5 5 43 9， EU 6 4 7 55 7。 2 3 P C 2河南分 离株全 基 因组 同源性 比较及 遗传 进 化分析测序结 果 显示 ， 1 O株 P C V2河 南株 全 基 因长度均 为 1 7 6 7 b p ， 与 P C V2的 另 一 亚 型 ( 1 7 6 8 b p ) 相 比 ， 在 1 0 4 2位 缺 失 1 碱 基 T。1 O株 P C V2 河南 株 全 基 因都 包 括 1 1个 潜 在 的 开 放 阅 读 框 ( ORF ) ， 其 中 0R F 1 ， 0R F 2是最 大 的 2个 ， 分 别 编码 复制 相关 蛋 白(R e p蛋 白)和病 毒衣壳 蛋 白(C a p蛋 白) 。同许多 已发 表 的 序列 相 比 ， 1 0株 P C V2河 南 株 全 基 因组 都具 有 保 守 的 茎环 结 构 ( 5 GAA GTG CGC TGT AAG TAT TAC CAG CGC ACT TC 一 3 )， 9碱基基序( 5 一 AAG T AT T AC 一 3 )以及潜在 的糖基 化位 点 ( N X S或 N X T， X 代 表 任 意氨 基 酸) 。1 0株 河 南 株 间 全基 因组 核 苷 酸 同源 率 为 9 8 0 oA 9 9 8 ， 其 中 J i a o z u o C N一 0 8 ( E U7 8 0 0 7 3 ) 与 L u o y a n g C N一 0 8 ( E U5 5 5 4 3 9 ) 同 源 率 最 低 ； 0R F I 核苷酸序列同源率为 9 6 9 9 9 8 ， Re p蛋 白氨 基酸同源率达 9 6 5 9 9 7 ； ORF 2核苷酸同源 率为 9 8 9 1 0 0 C a p蛋 白氨 基 酸 同源率 为 9 8 3 1 0 0 ； OR F 3的核 苷 酸 同源 率 为 9 7 1 1 0 0 ， 其 推 导 的 氨 基 酸 同 源 率 为 8 4 8 9 9 。 河 南 株 与 国 内 外 参 考 毒 株 比 较 ， I u o y a n g C N一 0 8 ( E U5 5 5 4 3 9 ) 与 丹 麦 株 ( E U1 4 8 5 0 7 )同 源 率 最 低 ( 9 3 4 ) ； Z h o u k o u C N一 0 8( E U6 5 6 1 4 3 ) 与 广 西 株 ( AY5 5 6 4 7 5 ) 同源率 最 高 ( 9 9 7 ) 。 5 0 0 0 0 0 2 5 0 5 00 7 5 0 5 00 2 5 0 囤 2 P CV2全 基 因组 重 组 质 粒 Hi n d 和 Kp n I双 酶 切 及 P C R鉴定M 2 5 0 b p DN A L a d d e r Ma r k e r 1 重组质 粒 p ML - Y P CV2； 2 Hi n d I I I 和 Kp n I酶 切 重 组 质 粒 p MD- P C V 2 ； 3 空载体 p MD L 1 8 - T； 4 重组 质粒 的 P C R 产物 ； 5 阴性对照 使 用 B o o t s t r a p p e d Ne i g h b o r J o i n i n g算 法 ， 基 于 5 O株 P C V( 4 8株 P C V2和 2株 P C V1 ) 全基 因组 序列 生 成系统 进 化树 结果 见 图 3 。 由图可 以看 出 ， P C V2分 为 两 大 分 支 I和 I I 。尽 管 毒 株 的 来 源 地 域 、 时间和临床表现不 同， 河南株均处于分 支 I中。 河 南株 的 8 1 8 ( 除 E U5 5 5 4 3 9和 AY 0 5 5 3 9 4外 ) 与 中国其 他一些 省 份 的 P C V2毒株 构成 亚分 支 I a ； 少 数 河 南 株 ( E U5 5 5 4 3 9 和AY 0 5 5 3 9 4 ) 、法 国 株 ( AY3 2 1 9 8 2 ) 、 英 国 株 ( DQ 9 1 5 5 8 7 、 AF 0 5 5 3 9 4 和 中 国 兽 医 学 报2 0 1 0 年 2 月 第 3 O 卷第 2 期 C h i n J V e t S c i F e b 2 0 1 0 V o 1 3 0 N o 2 1 6 9 A J 2 9 3 8 6 9 ) 和其他省份部分 P C V2毒株构成亚分支 I b 。法 国和 英 国 株 之 外 的 国 外 参 考 毒 株 和 中 国部 分省份 的毒 株 处 于 分 支 中。亚 分 支1I a由 4株 P C V2 中 国 株Hu b e i C N一 0 3 ，S h a n d o n g C N一 0 4 ， Ha i n a n CN一 0 4和 S h a n g h a i CN 0 4 ( AY2 9 1 3 l 7， AY一 5 5 6 4 7 3 ， AY5 5 6 4 7 6 和 AY 6 8 6 7 6 3 ) 构 成 ， 这 4 株 P C V 2全 基 因组 长 度 均 为 1 7 6 7 b p ； Ta i wa n C N一 0 2 和 Ta i wa n CN一 0 1( AF 3 6 4 0 9 4 和 AY1 4 6 9 9 2) ， Fu i i a n CN一 0 4 ( AY5 5 6 4 7 4 ) ， He b e i CN一 0 6 ( EF5 2 4 5 4 2 )。 B e i j i n g CN 一 0 1 ( AF 3 8 1 1 7 5) 和 国 外 参 考 毒 株 (AY1 1 77 5 3， EU l 4 85 0 6 EU 1 4 85 0 7， AF20l 30 6， AF4 5 4 5 4 6，AY0 9 4 6 1 9，AB 0 7 2 3 0 1 ，AF 0 5 5 3 9 1 和 AF O 2 7 2 1 7 ) 构 成 了另 一个 亚分 支 。在亚 分 支 I I b中 ， Ta i wa n C N O 2和 T a i wa n C N 一 0 1全 基 因 组 长 度 为 1 7 6 7 b p ； 丹 麦 株 D K9 6 ( E U1 4 8 5 0 7 ) 全 基 因 组 长 度 为 1 7 6 6 b p 。与 1 7 6 8 b p毒 株 比， Ta i wa n C N一 0 2和 Ta i wa n C N一 0 1在 1 0 0 2和 1 0 0 3处 缺 失 2个 T， 在 1 0 1 9处 多 1个 G； 丹 麦株 DK9 6在 1 0 0 2 ， l 0 0 3缺 失 2 个 T。其 他 毒株 基 因组全 长均 为 l 7 6 8 b p 。 F 0 58 3 9 1 A F 0 27 2 1 7 0 i 图 3 基于 P C V2全基因组核苷酸序列的遗传进 化分析 示 P CV2河 南 株 2 4 P C V 2河 南株 C a p蛋 白氨基 酸 比对和 抗原 性分 析应用 D NA S t a r ， 对河 南 株 ( AY 9 6 9 0 0 4 ， E F 0 2 8 2 0 2 ， EF 0 6 4 1 4 9 ， EF 0 6 4 1 5 0 ， EF4 6 7 9 2 8和 本 研 究 中 l O株 P C V2 ) 和 国 外 参 考 毒 株 ( AF 0 2 7 2 1 7 ， AF 0 5 5 3 9 4和 AF 3 2 1 9 8 2 ) 共 1 8株 P C V2的 C a p蛋 白核 苷 酸 及 氨 基 酸 序列 进 行 同源 性 分 析 ， 对 其 中 6株 河 南 株 和 1 株 参 考株 的 C a p蛋 白作 了抗 原 性 预 测 ， 结 果 分 别 见 图 4 ， 5 。 由图 4可 以看 出 ， 河 南 株 O RF 2的 长 度 均 为 7 0 2 b p ， 编码 2 3 3个氨基 酸 。在 C a p蛋 白 5个 主 要 的抗原 表位 区 A ( 5 7 9 1 ) ， B( 1 2 1 1 3 7 ) ， C ( 1 8 3 1 9 1 ) ， D ( 2 0 6 2 1 5 )和 E ( 2 3 O 2 3 3 ) 中_ s ， 河南 株 C a p蛋 白在 A( 6 3 ) 和 C( 1 9 0和 1 9 1 ) 有 明显 的 变 异 ； C a p蛋 白核 定 位信号 区 ( 3 1 ) 也 有 明 显 的变 异 。河 南 株 ( 特 别 是 2 0 0 7 2 0 0 8年 毒 株 ) C a p蛋 白 的其 余 区 域 的 氨基 酸 序 列 相 对 保 守 。 由 图 5可 以看 出 ， 2 0 0 5 2 0 0 8年 P C V2河 南 株 C a p蛋 白 的抗 原 性 没 有 明 显 的 变化 ， 相 对保 守 。 2 5 P C V 2河 南株 O R F 3蛋 白氨基 酸 比对 和 抗原 性 分 析 应 用D NAS t a r ， 对¨ 株 P C V2河 南 株 ( He n a n株 和本 研 究 中 的 l O株 P C V2 ) 和 3株 国外 参考毒株的 ( ) R F 3核苷酸及其推导的氮基酸序列进 行 同源 性 比较 ， 对 其 中 6株 河 南 株 和 1 株 参 考 株 的 ( ) RF 3蛋 白 作 了 抗 原 性 预 测 。 由 图 6可 以 看 出 ， P C V2河南 株 OR F 3蛋 白存 在 2个 主 要 的氨 基 酸 变 异 区 2 7 4 1 ， 6 2 6 3和 1 0 2 1 0 4 ( 图 6方 框 中) ； Xi n x i a n g C N一 0 7( E U5 2 1 7 0 9 ) OR F 3蛋 白氨 基 酸 5 8 6 6存 在 变 异 ；I u o y a n g C N一 0 8( E U5 5 5 4 3 9 ) 和 He n a n C N一 0 5的 OR F 3蛋 白氨基 酸仅 在 6 2 ， 6 3 有 差 异 。P C V2河 南株 ORF 3蛋 白 的其 余 氨 基 酸 序 列相 对保 守 。由图 7可 以看 出 P C V2河 南 株 OR F 3蛋 白氨基 酸存 在 3 5 7 0和 1 O ( ) 1 0 5两 个抗 原 性 高变 区( 图 7方 框 中 ) ；Lu o y a n g CN 0 8( EU5 5 5 4 3 9 )和 He n a n C N一 0 5 ( AY9 6 9 0 0 4 ) 的 ( ) R F 3蛋 白 在 氨 基 酸 5 7 6 3 的 抗 原 性 有 差 异 ；Xi n x i a n g - CN一 0 7 ( E U5 2 1 7 0 9 ) 和其 他 毒 株在 ( ) R F 3蛋 白氨基 酸 5 8 6 6的抗 原性 有 明显 差 异 。P C V2河 南株 ( ) R F 3蛋 白 3个 主 要 的 氨基 酸 变异 区 2 7 4 1， 6 26 3和 1 O 2 1 0 4的变 异 导致 其预 测 的抗 原 性 改 变 ； L u o y a n g - C N 一 0 8( EU5 5 5 4 3 9)和Xi n x i a n g CN一 0 7 (EU5 2 1 7 0 9) ORF 3蛋 白氨基 酸分 别 在 6 2 6 3和 5 8 6 6的变 异 导致 此 区域 预测 的抗 原性 改变 。 3 讨 论 P C V2的全 基 因组 存在 2种 长度 ， 一 种 为 l 7 6 8 b p ， 另一种为 l 7 6 7 b p 。从本研究看 ， 河南省仅流行 P C V2一种 亚 型( 1 7 6 7 b p ) 。 河 南株 与 P C V2另一 亚 型 ( 1 7 6 8 b p ) 相 比 在 1 0 , 1 2位 缺 失 1个 碱 基 “ T” ， l 0 3 5 “ T” 被 最 换 为 “ A” 。 C a p 蛋 白的 长度 未 改 变 ， 其 ) I 唧 。 。 。 。 J _ _ 1 _ - 三 一 _ _ l l 000 蚰 舯伯 7 O2 7 4 7 l O5 0 8 7 l 6 Zi I “ 驰 聃札 盯 虬 眦 ：8 耽 n =2 惦 盯 吖 惦 ¨ 1 7 0 中 国 兽 医 学 报2 0 1 0 年 2 月 第 3 O 卷第 2 期C h i n J V e t S c i F e b 2 0 1 0 V o 1 3 O N o 2 l P R RRY RR RRH RP RS HLG QIL R RRP W】 V l PR 王 珉啊 RRKN 6IF l 丌RLS RTF G1 r r 工超H 翻 P S WAVP 船聃 I HDr L _ V A R D - 。 V A R A K L。 V。 A 8 。 LL D V R G 。 。 。 L _ 。 ， L。 ， - L R - L H 。 。