SN-T-1151.2-2002.pdf
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1、SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/ T 1 1 5 1 . 2 -2 0 0 2 对虾白斑病毒( ws v ) 聚合酶链式反应( P C R) 检测方法 T e s t me t h o d o f p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) f o r w h i t e s p o t v i r u s ( WS V ) 2 0 0 2 一 1 1 一 2 5 发布2 0 0 3 一 0 5 一 01 实施 中华人民共和国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发 布 S N / T 1 1
2、5 1 . 2 -2 0 0 2 前言 本标准是在参考国 际上通用的检测规程和总结我国 在这一领域的 实践 经验的 基础上制定的。 本标准的附录A是资料性附录。 本标准由国 家认证认可监督管理委员会提出 并归口。 本 标准起草单位: 中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。 本标准主要起草人: 刘药、 史秀杰、 高隆英、 江育林。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 S N / T 1 1 5 1 . 2 -2 0 0 2 对虾白斑病毒( WS V ) 聚合酶链式反应( P C R ) 检测方法 范 围 本标准规定了 用聚合酶链式反应技术( P C R ) 检测对虾白 斑病毒( WS V ) 的
3、方法。 本标准适用于对虾白斑病毒的鉴定, 适用于本病的流行病学调查、 诊断、 检疫和监测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注 日 期的引用文件, 其随后所有 的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准, 然而, 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注 日 期的引用文件, 其最新版本适用于本标准。 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法( e q v I S O 3 6 9 6 : 1 9 8 7 ) 试剂和材料 3 . 1 水 应符合G B / T 6 6 8 2
4、 -1 9 9 2中一级水的规格。用于 P C R( 包括核酸抽提) 时所用的水要用 D E P C 处理。 3 . 2 T a q酶 一 2 0 保存, 不要反复 冻融或温度剧烈变化。 3 . 3 d N T P ( 含d C T P , d G T P , d A T P , d TT P各 1 0 m mo l / L ) 引 物浓度为4 0 p m o l / L 。 有两对引物, 使用时 浓度皆 为4 0 1s m o l / L , 其序列 分别为: 1 4 6 F 1 ; 5 - AC T A C T AA C T T C A G C C T A T C T A G3 ; 1 4
5、 6 R 1 : 5 - T A A T G C G G G T G T A A T G T T C T T A C C A - 3 , 扩增1 4 4 7 饰的片段; 1 4 6 F 2 : 5 - G TA AC T G C C C C T TC C AT C T C C A - 3 ; 1 4 6 R 2 : 5 - T A C G G C A G C T G C T G C A C C T T G T - 3 , 扩增上述片 段中的9 4 1 b y 片段。 3 . 4 无水乙醇 分析纯, 使用前预冷到一2 0 0C. 3 _ 5 矿物油 无 DNA酶和 RNA 酶。 仪器和设备 4
6、. 1 P C R扩增仪 4 . 2 电泳仪 4 . 3 微量移液器和吸头 4 . 4 紫外观察灯 4 . 5 恒温培养箱 4 . 6 普通冰箱和低温冰箱 S N/ T 1 1 5 1 . 2 -2 0 0 2 4 . 7 电动匀浆器 4 . 8 离心机和离心管 4 . 9 剪刀 4 . 1 0 摄子 白斑病毒D N A的鉴定 5 , 1 采样 取活虾和活虾的头部, 立即处理或放在 9 5 %酒精中( 可在常温下保存 3 0 d , 样品处理前必须让酒精 完 拿 挥 发 。 取5 0 m g - 1 0 0 m g 的 鳃 丝 ( 或 上 皮 、 肝 胰 腺 和 肠 ) ,放 在1 . 5 m
7、 L 的 离 心 管 中 。 5 . 2 样品处理 在1 5 下, 首先加人1 5 0 p L C T A B溶液( 见附录A . 1 ) , 用小剪刀剪 碎, 后用均浆器将样品均浆成 糊状。 再加C T A B 溶液到9 0 0 f L . 混匀后于2 5 作用 2 h , 5 . 3 D N A抽提 首先加6 0 0 p L抽提液1 ( 见附录A . 2 ) , 充分 混合至少3 0 s ; 1 2 0 0 0 r / m i n 离心5 m i n , 取上层水相; 再加7 0 0 p L 抽提液2 ( 见附录A . 3 ) , 充 分混合3 0 s ; 1 2 0 0 0 r / m
8、i n 离心5 m i n , 取上层水相; 然后加 人1 . 5 倍体积的一2 0 无水乙醇, 混匀后, -2 0 放置 6h以上; 1 5 0 0 0 r / m i n离心 3 0 m i n , 弃上清, 立即用滤 纸吸干, 3 7 干燥2 0 m i n ; 最后加1 0 p L 水溶解后, 作为P C R 模板。 5 . 4 第一步 P C R扩增D N A 在1 . 5 m L 离心管中加人T a q 酶用1 0 倍缓冲液( 见附录A . 7 ) 1 0 p L , 2 5 m m o l/ I抓化镁( M g c l , ) ( 见附录A . 6 ) 1 0 ,u L , d
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