SN-T-1151.2-2002.pdf
SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/ T 1 1 5 1 . 2 -2 0 0 2 对虾白斑病毒( ws v ) 聚合酶链式反应( P C R) 检测方法 T e s t me t h o d o f p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) f o r w h i t e s p o t v i r u s ( WS V ) 2 0 0 2 一 1 1 一 2 5 发布2 0 0 3 一 0 5 一 01 实施 中华人民共和国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发 布 S N / T 1 1 5 1 . 2 -2 0 0 2 前言 本标准是在参考国 际上通用的检测规程和总结我国 在这一领域的 实践 经验的 基础上制定的。 本标准的附录A是资料性附录。 本标准由国 家认证认可监督管理委员会提出 并归口。 本 标准起草单位: 中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。 本标准主要起草人: 刘药、 史秀杰、 高隆英、 江育林。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 S N / T 1 1 5 1 . 2 -2 0 0 2 对虾白斑病毒( WS V ) 聚合酶链式反应( P C R ) 检测方法 范 围 本标准规定了 用聚合酶链式反应技术( P C R ) 检测对虾白 斑病毒( WS V ) 的方法。 本标准适用于对虾白斑病毒的鉴定， 适用于本病的流行病学调查、 诊断、 检疫和监测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注 日 期的引用文件， 其随后所有 的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注 日 期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法( e q v I S O 3 6 9 6 : 1 9 8 7 ) 试剂和材料 3 . 1 水 应符合G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2中一级水的规格。用于 P C R( 包括核酸抽提) 时所用的水要用 D E P C 处理。 3 . 2 T a q酶 一 2 0 保存， 不要反复 冻融或温度剧烈变化。 3 . 3 d N T P ( 含d C T P , d G T P , d A T P , d TT P各 1 0 m mo l / L ) 引 物浓度为4 0 p m o l / L 。 有两对引物， 使用时 浓度皆 为4 0 1s m o l / L ， 其序列 分别为: 1 4 6 F 1 ; 5 ' - AC T A C T AA C T T C A G C C T A T C T A G3 ' ; 1 4 6 R 1 : 5 ' - T A A T G C G G G T G T A A T G T T C T T A C C A - 3 ' ， 扩增1 4 4 7 饰的片段; 1 4 6 F 2 : 5 '- G TA AC T G C C C C T TC C AT C T C C A - 3 ' ; 1 4 6 R 2 : 5 ' - T A C G G C A G C T G C T G C A C C T T G T - 3 ' ， 扩增上述片 段中的9 4 1 b y 片段。 3 . 4 无水乙醇 分析纯， 使用前预冷到一2 0 0C. 3 _ 5 矿物油 无 DNA酶和 RNA 酶。 仪器和设备 4 . 1 P C R扩增仪 4 . 2 电泳仪 4 . 3 微量移液器和吸头 4 . 4 紫外观察灯 4 . 5 恒温培养箱 4 . 6 普通冰箱和低温冰箱 S N/ T 1 1 5 1 . 2 -2 0 0 2 4 . 7 电动匀浆器 4 . 8 离心机和离心管 4 . 9 剪刀 4 . 1 0 摄子 白斑病毒D N A的鉴定 5 ， 1 采样 取活虾和活虾的头部， 立即处理或放在 9 5 %酒精中( 可在常温下保存 3 0 d , 样品处理前必须让酒精 完 拿 挥 发 。 取5 0 m g - 1 0 0 m g 的 鳃 丝 ( 或 上 皮 、 肝 胰 腺 和 肠 ) ，放 在1 . 5 m L 的 离 心 管 中 。 5 . 2 样品处理 在1 5 下， 首先加人1 5 0 p L C T A B溶液( 见附录A . 1 ) ， 用小剪刀剪 碎， 后用均浆器将样品均浆成 糊状。 再加C T A B 溶液到9 0 0 f L . 混匀后于2 5 作用 2 h , 5 . 3 D N A抽提 首先加6 0 0 p L抽提液1 ( 见附录A . 2 ) ， 充分 混合至少3 0 s ; 1 2 0 0 0 r / m i n 离心5 m i n ， 取上层水相; 再加7 0 0 p L 抽提液2 ( 见附录A . 3 ) ， 充 分混合3 0 s ; 1 2 0 0 0 r / m i n 离心5 m i n ， 取上层水相; 然后加 人1 . 5 倍体积的一2 0 无水乙醇， 混匀后， -2 0 放置 6h以上; 1 5 0 0 0 r / m i n离心 3 0 m i n ， 弃上清， 立即用滤 纸吸干， 3 7 干燥2 0 m i n ; 最后加1 0 p L 水溶解后， 作为P C R 模板。 5 . 4 第一步 P C R扩增D N A 在1 . 5 m L 离心管中加人T a q 酶用1 0 倍缓冲液( 见附录A . 7 ) 1 0 p L , 2 5 m m o l/ I抓化镁( M g c l , ) ( 见附录A . 6 ) 1 0 ,u L , d N T P 2 p L 、 引物1 4 6 F 1 和1 4 6 R 1 各2 . 5 p L , T a q 酶( 见附录A . 8 ) 5 U , 1 0 p L 待 测样品D N A为模板， 最后加水到1 0 0 p L 水。 在反应混合物上 覆加5 0 p L 矿物油。 低速离心使混合物集中在离心管的底部， 让矿物油在上层。将离心管置于 P C R扩增仪中。首先 9 4 'C 加热变性4 min ; 再9 4 'C 1 mi n -5 5 'C 1 mi n -7 2 'C 2 min , 3 0次循环; 然后 7 2 'C 1 0 mi n ; 最后 4 'C 保温 . 55 琼脂糖电泳 用T B E 电 泳 缓 冲 液 ( 见 附 录A . 4 ) 配 制1 % 的 琼 脂 糖 含。 . 5 p g / m L E B ( 见 附 录A . 5 ) 平板 。 将 平 板放人 水平电 泳槽， 使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6 p L P C R扩增产物和2 p L电泳样品缓冲液( 见 附录A . 9 ) 混匀后加人样品孔。5 V / c m电泳约 3 0 mi n ， 当澳酚蓝到达底部时停止。 在紫外灯下观察核酸带并判断结果。 5 ， 6设立对照 5 . 6 . 1 取已知阳 性的 对虾组织D N A 1 0 砂， 为模板， 作为阳性对照。 5 . 6 . 2 取已知阴 性的 对虾 组织D N A 1 0 p L 为模板， 作为阴性对照。 5 . 6 . 3 用1 0 p L 水作为 模板， 作为空白 对照。 5 . 7 嵌套式 P C R反应 5 . 7 . 1 如果第一次P C R扩增后的产物电泳时看不到D N A带， 取 5 p L 作为模板; 如果能看到D N A 带， 只 是 做 进 一 步 的 核 实， 则 需将 产 物 按1 ， 1 0 0 0 稀释 后， 取5 p L 作 为 模 板。 5 . 7 . 2 在1 . 5 m L离心管中加人以下试剂: 1 0 倍的T a q 酶用缓冲液1 0 . p L , 2 5 m m o l/ L的氯化镁 ( M g C l z ) 1 0 p Ld N T P 2 p L 、 引物1 4 6 F 2 和1 4 6 R 2 各2 , 5 p L , T a q 酶5 U ， 加水至1 0 0 p L 每管中 加人 5 0 P I 矿物油。 5 . 7 . 3 P C R扩增程序同5 . 4 e 5 . 7 . 4 琼脂糖电泳程序同 5 . 5 . 5 . 7 . 5霍紫外灯下观赛核酶带#判断结奥 S N/ T 1 1 5 1 . 2 -2 0 0 2 6 结果判定 6 . 1 第一次P C R扩增后， 阳 性对照会出现一条1 4 4 7 b y 的D N A片段。阴 性对照和空白 对照 没有该核 酸带。 6 . 2 第二次P C R后， 阳 性对照会出现一条9 4 1 饰 的D N A片段。阴性对照和空白对照均没有该核 酸带。 6 . 3 待测样品第一次 P C R扩增后经电泳能出现1 4 4 7 b y 的带， 或经第二次P C R后经电泳出现 9 4 1 b y 的D NA片段的核酸带均可判为阳性。 6 . 4 待测样品 经P C R 扩增后电 泳没有出现D N A带， 或者带的大小不是 1 4 4 7 b y 或者9 4 1 b y 的均判 为阴性. S N/ T 1 1 5 1 . 2 -2 0 0 2 附录A ( 资料性 附录) 试荆配制 A . 1 C T A B溶液 按2 0 o C TA B , 1 . 4 mo l / L氯化钠( Na C D, 2 0 mmo l / L E D T A, 2 0 mo t / L T r i s - H C l p H7 . 5 配制。用 前加琉基乙醇到终浓度为。2 5 %. A2 抽提液 1 三氯甲烷/ 异戊醇( 将三氯甲烷和异戊醇按 2 4: 1 的比例混合， 密闭避光保存) 。 A . 3 抽提液2 酚/ 三氯甲 烷/ 异戊醇( 用1 m o l / L p H 7 . 9 士。 . 2 T r i s 饱和过的重蒸酚 ， 三氯甲 烷 ， 异戊醇按 : 2 4; 1 的比例混合， 密闭避光保存) 。 4 T B E电泳缓冲液( 5 倍浓缩液) 扎儿 T r i s 5 4 . 0 g 硼酸2 7 . 5 g ED TA 2 . 9 g 加水到1 0 0 0 . 0 MI 用 5 mo l / L的HC l 调p H到 8 . 0 . A . 5 E B ( 核酸染色剂) 用水配制成1 0 m g / m L 的浓缩液。 用时每1 0 m L 电泳液或琼脂中 加1 p L . A . 6 氛化镁( Mg C l z ) 2 5 m mo l / L A . 7 T a q酶用 1 0 倍浓缩缓冲液( 1 0 x b u f f e r ) Tr i s - H Cl 氯化钾( K C l ) Tr i t o n X - 1 0 0 5 0 0 m mo l/ L p H 8 . 8 5 0 0 mmo l/ L 1 % A . 8 T a q酶 5 U / k L A . 9 4 x电泳样品缓冲液 每1 0 0 m L溶液中含澳酚蓝 0 . 2 5 g ， 蔗糖 4 0 g . *草庐一苇草庐一苇*提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 本人有各种国内外标准 20 余万个， 包括全系 列 GB 国标国标及国内行业行业及部门标准部门标准，全系列 BSI EN DIN JIS NF AS NZS GOST ASTM ISO ASME SSPC ANSI IEC IEEE ANSI UL AASHTO ABS ACI AREMA AWS ML NACE GM FAA TBR RCC 各国船级 社 船级 社 等大量其他国际标准。豆丁下载网址：豆丁下载网址： http:/www.docin.com/liuyx866
