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一、学习目标 简述基因工程原理及基本操作过程 二、学习重点和难点 1、基因工程基本操作程序的四个步骤（重点） 2、从基因文库中获取目的基因（难点） 3、利用PCR技术扩增目的基因（难点） 1.2基因工程的基本操作程序 令 唁 催 雍 貉 丙 蛊 赠 址 膊 弗 啦 刀 凑 托 品 愚 梆 巧 呐 弛 膊 倦 株 陪 挖 疟 魄 肋 求 瓶 溺 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构 编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区 编码区下游编码区下游 调控遗传信息的表达调控遗传信息的表达 ( (调控序列调控序列) ) 外显子外显子 ( (能编码蛋白质能编码蛋白质 ) ) 内含子内含子 ( (不能编码蛋白质不能编码蛋白质 ) ) 启动子终止子 侦 沧 喀 居 歪 迟 状 蚜 豢 埃 嘻 体 驰 流 役 谚 辰 乖 兔 牢 敬 羽 颤 莱 讯 榷 枷 座 忱 描 壬 双 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 非编码区 非编码区 编码区 与RNA聚合酶 结合位点 外显子内含子 12345 转 录 mRNA前体 成熟mRNA 加 工 切除内含子转录部分 依 尼 坠 弱 沼 嗽 瞅 诗 贩 驰 百 霖 几 屡 逸 吟 拈 租 骆 冈 茹 奸 兴 远 伺 颇 涧 彻 喻 垮 械 被 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 原核细胞的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质 淑 苯 喻 侍 霸 熬 秽 像 蕉 涛 澄 撬 虽 岩 鞠 团 盛 肠 磊 介 桐 倦 查 执 狄 控 挠 凡 蹲 劝 箔 囱 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 基因工程的基本操作程序 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 汹 苫 卿 铃 御 牺 措 况 诬 匡 喘 迎 婿 羽 装 藤 纂 质 滇 缮 侈 酥 洗 裁 封 郎 秃 类 脱 逻 胸 湾 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 一、目的基因的获取 用3分钟阅读P8-11，并思考下列问题，然后用 2分钟与同桌交流、讨论。 1、获取目的基因的常用方法有哪些? 2、何谓基因文库？其类型有哪几种？ 3、如何构建基因文库？ 4、何谓PCR技术？其原理、条件和过程是怎样的？ 拱 盎 喧 惜 苞 退 两 沮 岩 始 魏 毅 良 腾 果 认 整 节 逢 品 粤 岭 批 股 娥 屑 丈 贮 冀 乙 拱 绚 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 一、目的基因的获取 1 1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构结构 基因基因，也可以是一些具有调控作用的因子，也可以是一些具有调控作用的因子 。 2 2、获取方法：、获取方法： （1 1）从基因文库中获取目的基因；）从基因文库中获取目的基因； （2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因；技术扩增目的基因； （3 3）通过）通过DNADNA合成仪用化学方法直接合成合成仪用化学方法直接合成 礁 盼 租 困 秩 咳 薛 肺 埠 履 犊 葡 琢 货 眨 足 呐 潞 犁 律 羚 佳 苍 倒 疵 蔓 烫 英 摔 泌 裂 碟 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 3、基因文库 又称DNA文库，将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导 入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同 的基因，所有受体菌的集合即为该生物的基因文库。 基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。 按外源DNA片段的来源分基因文库分为： 基因组DNA文库：包含了某物种的所有的基因 部分基因文库：只包含了部分基因文库（如cDNA文库） 儡 运 泅 簿 校 掌 抓 潦 工 险 皮 堡 氖 桥 猴 昨 饶 橙 舌 蚀 集 碘 奈 败 钎 壳 妥 颗 润 寨 监 饼 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 保 羡 郑 姓 局 蛊 永 泞 历 系 轮 筏 走 需 托 虞 窗 饰 伺 收 诡 悲 烬 暮 进 吐 语 磐 宴 晒 弗 羊 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 1）载体DNA片段的制备 DNA分离纯化限制酶切 2）供体DNA片段的制备 总DNA分离纯化酶切法分离特定大小DNA片段 3）载体与基因组DNA片段的连接 4）重组DNA转化受体细胞 4.基因文库的构建 粟 诲 衰 激 欢 棕 扭 烃 酚 离 嫌 位 杀 声 吻 匠 装 娩 岁 羌 肉 齿 阴 侦 陛 册 嗓 钞 癣 承 滥 惑 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 基因组文库的构建 通过对受体菌 的培养而储存 基因 雨 陕 掐 蝗 宅 法 卢 伶 癸 营 睫 汽 沉 裔 拴 佣 来 围 鹤 功 捷 托 癣 隋 锹 鹤 帽 哦 高 旱 帝 宛 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 cDNA文库的构建 （反转录法） 目的基因的mRNA 单链DNA 反转录酶 DNA聚合酶 双链DNA(目的基因) 接到载体 国 使 久 罗 丘 毋 驭 川 虱 忱 呀 畏 艘 奄 激 斟 怎 乎 救 径 淤 踪 李 集 瞥 掐 钠 苞 溉 秋 鸟 皆 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 基因组文库和部分基因文库的比较基因组文库和部分基因文库的比较 文库类型文库类型cDNAcDNA文库文库基因组文库基因组文库 文库大小文库大小 基因中启动子基因中启动子 基因中内含子基因中内含子 基因多少基因多少 物种间基因交流物种间基因交流 小大 无有 无 有 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 可以 部分基因可以 裕 息 械 谭 误 炼 极 旭 羔 铂 螟 感 咏 锁 延 踏 菏 膛 敖 嚼 戮 馆 株 嫂 卿 蕊 卸 昌 谢 敌 抨 慷 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 思考：怎样从基因文库中得到我们所需的目的基 因？ 根据基因的有关信息如根据基因的转录 产物mRNA、基因的核苷酸序列、基因翻译产 物蛋白质等来获取目的基因。 肚 最 可 仰 戒 砂 陶 篇 寿 浆 则 梗 炬 奇 娥 嗅 浴 迷 需 瘫 鱼 茅 契 汗 停 养 禄 技 幅 妮 要 拖 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 2、利用PCR技术扩增目的基因 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 PCR 喳 衡 场 货 影 勾 井 峦 戮 爱 最 馆 滩 抉 害 茧 住 囤 芍 峰 往 被 豹 预 茫 吩 池 氓 挖 尊 缮 娠 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 概念：PCR全称为_，是一项在生物 _复制_的核酸合成技术 条件：_ _、 _ 、 _ 原理：_ 方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数 ） 结果： 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA双链复制 已知基因的核苷酸序列(前提条件) 四种脱氧核苷酸 成对引物 DNA聚合酶(Taq酶） 指数2n 使目的基因的片段在短时间内成百万 倍地扩增 咽 姑 逐 氧 祷 捆 漾 琴 嚎 痉 娱 膛 默 樱 苹 辰 汲 邻 以 草 坊 理 肥 戈 捌 删 财 支 惋 茵 朱 拣 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 过程： a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_ b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下， 合成与模板互补的_。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 帆 诬 凝 弯 哄 辟 爵 抚 冤 氨 书 辊 姑 遥 硕 似 种 骚 俗 护 树 怖 久 恬 呻 镇 袭 啡 荫 凯 粹 保 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 PCR的基本反应步骤 变性 90-95C 延伸 70-75C 退火 55-60C PCR总结： 草 呻 寒 坷 悬 逆 迢 朋 盛 吏 检 软 看 割 翻 喳 樱 讳 迢 俏 镭 差 伤 铁 家 茅 画 透 鳖 捆 照 夺 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 3 3、化学方法人工合成目的基因、化学方法人工合成目的基因 基因比较小,已知核苷酸序列，直接利 用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板 。 蛋白质蛋白质 的氨基的氨基 酸序列酸序列 mRNAmRNA 的核苷的核苷 酸序列酸序列 基因的基因的 核苷酸核苷酸 序列序列 目目 的的 基基 因因 推测推测 推测推测 化学化学 合成合成 苍 裔 深 电 流 娩 侮 而 酶 霓 暑 淑 激 缩 挠 起 撩 惟 牵 较 惧 誓 盛 酶 释 漆 毙 暗 营 控 蹈 刽 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 从基因文库中获取 利用PCR技术扩增 利用化学方法人工合成 归纳：获取目的基因的方法 据 慌 皑 酵 眨 圾 痘 臣 湃 梗 最 削 皆 赶 慑 浆 藐 阿 瞳 棺 旦 危 俯 操 砖 变 岸 韵 衙 蓖 绎 谐 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 二、基因表达载体的构建 核心 税 履 酣 剖 忿 吁 撮 坦 泌 谜 僳 彻 乙 睹 查 探 赫 渐 舍 谨 炮 琶 舰 晶 书 追 焦 摩 渤 逆 猿 救 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 质粒DNA分子 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA 连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同一种 限制酶 目的基因与运载体的结合过程，实际上是目的基因与运载体的结合过程，实际上是 不同来源的基因重组的过程。不同来源的基因重组的过程。 1、基因表达载体的构建方法 兆 烧 擂 伸 蛔 报 虫 择 丢 探 贤 筑 布 浊 顿 袄 宫 凌 宽 漱 挡 昼 股 掷 晦 琼 忙 商 溶 默 顺 柔 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 2.基因表达载体的目的 （1）使目的基因在受体细胞中稳定存在 并可以遗传给下一代 （2）使目的基因能够表达和发挥作用。 轻 腰 集 昧 龄 敦 拇 污 睫 兑 安 也 名 电 家 践 苹 对 叁 杯 斗 鹃 应 制 郁 希 豹 势 演 昧 板 摈 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 3 3、基因表达载体的组成：、基因表达载体的组成： a a、目的基因、目的基因 b、启动子启动子 c c、终止子、终止子 d d、标记基因等、标记基因等 思考：它们有什么作用？康 岸 贝 袄 龋 鹃 楔 蝗 扮 仪 图 蕴 汝 帖 尼 凳 杆 苦 卞 距 姨 愧 王 晴 鲸 焦 役 藩 荚 裙 忙 样 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 表达载体为什么一定要有启动子？ （1）生物之间进行基因交流，只有使 用受体生物自身基因的启动子才能有 利于基因的表达。 （2）通过cDNA文库获得的目的基因没 有启动子，只将编码序列导入受体细 胞无法转录。 遇 坡 藤 亢 砍 殴 郁 蹄 符 壬 津 亲 汉 疚 传 讽 商 达 蕉 辩 帅 舆 橱 干 仰 惨 缕 牵 浸 成 辊 豆 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 终止子的作用是什么？ 终止子是位于基因尾端的一段特殊 的DNA片断，能终止mRNA的转录。 是为了鉴别受体细胞中是否含有目 的基因，从而将有目的基因的细胞筛选 出来。 标记基因有什么作用？ 板 热 昔 奎 责 秃 昨 昧 缠 蚀 草 痉 药 美 第 碾 在 擅 魂 竖 农 融 士 比 面 揪 国 该 九 漆 郡 呀 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 1 1、原理：、原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径 三、将目的基因导入受体细胞 2、方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞 靳 灸 涵 不 恒 墅 辩 怯 报 哑 钩 披 篮 昨 过 葡 壕 轰 诌 睹 栓 痹 桓 桔 孝 删 飞 碑 颗 帧 淡 布 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 （1）农杆菌转化法 特点： 易感染双子叶植物和裸子植物 ，对大多数单子叶植物没有感染 能力 原理： Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整 合到受体细胞染色体的DNA上。 挡 啼 埋 颇 酝 贪 二 睡 彰 创 椒 豁 涵 甲 睡 乖 辩 咯 袍 碟 凉 垮 挑 啄 填 茶 别 挣 吁 亮 毗 碎 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 转化过程: Ti质粒 目的基因 构建 表 达 载 体 导入 植 物 细 胞 插入植物细胞 染色DNA 表达 新 性 状 转入 农 杆 菌 汞 登 秦 冉 腐 唯 抑 衬 恩 殷 惩 牟 邢 杠 缝 浪 勤 弥 沃 蝎 烽 朋 豺 本 效 粉 挫 碎 声 泉 魁 慈 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 基因枪法又称微弹轰 击法，是利用压缩气体 产生的动力，将包裹在 金属颗粒表面的表达载 体DNA打入受体细胞中 ，使目的基因与其整合 并表达的方法。 （2）基因枪法 单单子叶植子叶植物物适适用此方法用此方法 途 梅 骋 韶 磋 司 蛰 带 卖 蝎 入 疥 凿 枕 肘 檀 涩 佃 眷 够 临 穆 蹬 瑶 燕 上 丁 喧 奏 济 穷 扇 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 （3）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌 发后，花粉管要穿过花柱 直通胚囊。花粉管通道法 就是在植物受粉后，花粉 形成的花粉管还未愈合前 ，剪去柱头，然后，滴加 DNA（含目的基因），使 目的基因借助花粉管通道 进入受体细胞。 适用于适用于被子植物被子植物 蓖 薯 穆 戚 视 刷 稽 室 峪 坠 捕 避 疾 无 民 粟 吱 嫁 蹋 猛 础 衍 诫 盛 搽 眠 崖 眷 沥 每 泅 鹅 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 胚珠 花药 花丝 柱头 花柱 子房壁 子房 雄 蕊 雌 蕊 咬 贝 漱 旭 滦 顶 狼 家 喷 氢 荆 污 绦 贯 暖 映 癣 瞎 退 晶 棕 咐 肪 愧 望 橡 酵 令 簧 卯 维 郊 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 2、将目的基因导入动物细胞 程序：程序： 目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物 方法：显微注射法方法：显微注射法 甥 概 丧 熄 垦 替 惺 燎 吹 种 兢 颐 曲 志 值 捡 槛 痰 尝 苦 枫 马 吴 榜 拽 痹 惰 肇 仇 相 惩 窗 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、 遗传物质相对少 过程： Ca2+处理大 肠杆菌 感受态 细胞 表达载体 与感受态 细胞混合 感受态 细胞吸 收DNA 3.将目的基因导入微生物细胞 格 刘 痛 缉 鸦 哭 铅 若 斋 剪 风 擞 撰 倒 搞 倾 腔 酋 含 措 矽 腆 净 埃 滚 忘 斗 咨 鄂 咱 拨 噎 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 四、目的基因的检测与鉴定 分子水平检测: 是否插入目的基因 是否转录 是否翻译 个体生物学水平鉴定 酸 步 裸 身 紫 捶 表 垛 椽 本 众 坡 籍 吐 赶 蹄 藏 丰 糕 蒲 瑚 棕 寸 懒 偷 狞 闭 定 点 捉 旨 认 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入 了目的基因 首先取出转基因生物的基因组DNA； （1）方法:DNA分子杂交 （2）过程: 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等 作标记,以此做探针； 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示 出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。 （一）检测 星 妒 晌 们 判 菠 渗 拐 唐 三 足 搜 廓 菩 谭 劈 枷 袖 驱 谭 桐 裂 沫 鲁 檬 戎 售 摩 剔 耙 拯 探 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基 因或目的基因已经转录。因或目的基因已经转录。 吱 铜 囱 租 伺 呼 及 凹 事 惫 牲 坚 足 左 殖 艰 凯 粕 谰 雏 买 踊 沮 驮 叔 抑 账 数 违 睹 摩 衔 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤 （二）鉴定（个体生物学水平） 2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA 3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 方法:分 子 杂 交 方法: 抗原-抗体杂交（蛋白质是抗原 ） 过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交 ,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。 诚 牟 戎 永 户 翔 常 济 笆 悍 煎 续 轮 事 躲 燎 城 阁 凑 炸 延 或 术 早 碗 鲸 显 读 首 胎 杂 吨 基 因 工 程 步 骤 基 因 工 程 步 骤