1、一一 PCR技术技术PCR概念 PCR的原理PCR中的注意事项PCR的主要类型什么是什么是PCR?多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称技术，是一种在DNA聚合酶作用下体外扩增特异片段的技术。PCR技术操作简便，可在短时间获得数百万个特异的目的序列的拷贝。80年代中期PCR技术的发明，引起了生物技术发展的一次革命，目前已被广泛应用于与分子生物学相关的各个领域。PCR反应的几个要素反应的几个要素DNA聚合酶聚合酶 生产机器生产机器 模板（要扩增的模板（要扩增的DNA）引物引物 dNTPs 原料原料Buffer（缓冲液）（缓冲液）稳定的环境稳定的环境Mg 2+等等
2、 润滑剂润滑剂模具模具7272（延伸）（延伸）95959595（变性）（变性）5050（退火）（退火）PCRPCR循环（循环（循环（循环（25-3525-35个）个）个）个）PCR反应步骤反应步骤模板DNA95变性变性(denaturaion)50引物1引物2DNA引物退火退火(annealing)引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶延伸延伸(extension)第1轮结束95第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA（1）第1轮扩增（2）第2轮扩增（4）第3轮扩增（8）第4轮扩增（16）第5轮扩增（32=232=25 5）标准的标准的PCRPCR反应体系反
3、应体系4种dNTP混合物 各200umol/L上下游引物 各10100pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+1.5mmol/L1）PCR反应成分（1 1）模板）模板 模板可以模板可以是是DNADNA，也可以是，也可以是RNARNA（反转录（反转录PCRPCR），），既可以是双链，也可以是单链。既可以是双链，也可以是单链。不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNADNA聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、DNADNA结合蛋白类。结合蛋白类。一般一般100ng DNA100ng DNA模板模板/100/100 L L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板浓
4、度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应条件（2）Taq DNA聚合酶（Taq酶）DNA聚合酶的主要活性是在具备模板、引物、聚合酶的主要活性是在具备模板、引物、dNTP等等存在的情况下催化存在的情况下催化DNA的合成。的合成。Taq酶来自水生嗜热菌酶来自水生嗜热菌 Thermus aquaticus特点：特点：1.良好的耐热性良好的耐热性 在在7080具有最高聚合活性具有最高聚合活性 在在95 仍然可以有仍然可以有50%活性活性 2.Mg2+依赖性依赖性 3.扩增时扩增时3末端凸出一个末端凸出一个A 碱基碱基 3.无校正功能无校正功能 一般一般一般一般PCRPCR中酶的用量为中酶的用量为中酶
5、的用量为中酶的用量为0.5-2.5 U/50 0.5-2.5 U/50 l l，酶量增加使反应，酶量增加使反应，酶量增加使反应，酶量增加使反应 特异性下降，酶量过少影响反应产量。特异性下降，酶量过少影响反应产量。特异性下降，酶量过少影响反应产量。特异性下降，酶量过少影响反应产量。（3）引物 引物浓度：0.1-0.5 0.1-0.5 mol/Lmol/L 浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下反应特异性下降。降。引物设计：引物设计：引物设计：引物设计：（1 1）引物序列特异性好，与非扩增区无同源性。）引物序列特异性好，与非扩增区无同源性。）引物序列特异性好，与非扩
6、增区无同源性。）引物序列特异性好，与非扩增区无同源性。（2 2）引物长度以）引物长度以）引物长度以）引物长度以15-40 bp15-40 bp为宜。为宜。为宜。为宜。（3 3）碱基尽可能随机分布碱基尽可能随机分布碱基尽可能随机分布碱基尽可能随机分布，G+CG+C占占占占40-60%40-60%。（4 4）引物）引物）引物）引物TmTm在在在在5050-65-65之间，两条引物的之间，两条引物的之间，两条引物的之间，两条引物的TmTm应接应接应接应接近，不能相差太大。近，不能相差太大。近，不能相差太大。近，不能相差太大。（5 5）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避
7、免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。（6 6）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。（7 7）引物）引物）引物）引物33端端端端与模板序列要严格配对，与模板序列要严格配对，与模板序列要严格配对，与模板序列要严格配对，33端避免出现端避免出现端避免出现端避免出现3 3个个个个或或或或3 3个以上连续相同的碱基个以上连续相同的碱基个以上连续相同的碱基个以上连续相同的碱基 ；引物；引物；引物；引物 55端端端端无严格限制。无严格限制。无严格限制。无严格限制。335535 5限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列限制性内切酶
8、的识别序列限制性内切酶的识别序列启动子序列启动子序列启动子序列启动子序列定点突变定点突变定点突变定点突变探针标记探针标记探针标记探针标记（4）dNTP dNTPdNTP：d dA ATPTP，d dT TTPTP，d dG GTPTP，d dC CTPTP dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度 四种四种dNTPdNTP浓度应相等浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量降低反应产量 dNTP dNTP可与可与MgMg2+2+结合，使游离的结合，使游离的MgMg2+2+浓度下降，影浓度下降，影响响DNADN
9、A聚合酶的活性。聚合酶的活性。（5）Mg2+MgMg2+2+是是DNADNA聚合酶的激活剂。聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。反应体系。MgMg2+2+浓度过低会使浓度过低会使TaqTaq酶活性丧失、酶活性丧失、PCRPCR产量下降；产量下降；MgMg2+2+过高影响反应特异性。过高影响反应特异性。MgMg2+2+可与负离子结合，所以反应体系中可与负离子结合，所以反应体系中dNTPdNTP、EDTAEDTA等的浓度影响反应中游离的等的浓度影响反应中游离的MgMg2+2+浓度。浓度。（6 6）缓冲液（）缓冲液（BufferBuf
10、fer）10mmol/L TrisHCl 调节PH，使Taq酶活性作用环境维持在扁碱性（pH8.3,室温）50mmol/L KCL 有利于引物的退火，但过高会抑制Taq酶活性 0.01%明胶 保护酶不变性失活 2）循环参数(1)变性 (2)使双链使双链DNADNA解链为单链解链为单链 95 95o oC 20-30C 20-30秒秒(2)退火 退火温度由引物退火温度由引物TmTm值决定，一般为值决定，一般为(1)Tm 5 Tm 5 1010(2)增加温度能减少引物与模板的非特异性结合增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸 70
11、75oC(温度取决于聚合酶的活性）温度取决于聚合酶的活性）延伸时间由扩增片段长度及DNA 聚合酶的延伸速度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加一个典型PCR体系反应体系（50 ul）：Taq酶 2.5 U 10 x Buffer 5 uldNTP(2.5mM)4 ulDNA模板 0.12ug上游引物(10P)2 ul下游引物(10P)2 ul H2O 补足至50 ul总计 50 ul反应流程（以扩增片段大小为800bp为例）：95 5 min 95 30 s 55 30 s 72 1 min 72 5 min 4 -30个
12、循环PCR的特点1.特异性强特异性强2.灵敏度高灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(g=10-6)水平3.简便、快速简便、快速 PCR反应一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广4.对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测PCR常见问题 假阴性，无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性无扩增产物1.1.模板模板:含有抑制物，含
13、量低含有抑制物，含量低2.2.BufferBuffer对样品不合适对样品不合适3.3.引物设计不当或者发生降引物设计不当或者发生降解解4.4.反应条件：反应条件：退火温度太高，延退火温度太高，延伸时间太短伸时间太短 原原因因对对策策1.1.纯化模板或者使用试剂盒提取纯化模板或者使用试剂盒提取模板模板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量2.2.更换更换BufferBuffer或调整浓度或调整浓度3.3.重新设计引物（避免链间二聚重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一体和链内二级结构）或者换一管新引物管新引物4.4.降低退火温度、延长延伸时间降低退火温度、延长延伸时间现象：正
14、对照有条带，而样品则无正对照有条带，而样品则无；非特异性扩增 现现象象：PCRPCR扩扩增增后后出出现现的的条条带带与与预预计计的的大大小小不不一一致致，或或大大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。1.1.引物特异性差引物特异性差2.2.模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高3.3.酶量过多酶量过多4.4.MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高5.5.退火温度偏低退火温度偏低6.6.循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策1.1.重新设计引物或者使用巢重新设计引物或者使用巢式式PCRPCR2.2.适当降低模板或引物浓度适当降低模板或引物浓度
15、3.3.适当减少酶量适当减少酶量4.4.降低镁离子浓度降低镁离子浓度5.5.适当提高退火温度或使用适当提高退火温度或使用二阶段温度法二阶段温度法6.6.减少循环次数减少循环次数 非特异性扩增 拖尾 现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈Smear状态状态。M 1 21.1.模板不纯模板不纯2.2.BufferBuffer不合适不合适3.3.退火温度偏低退火温度偏低4.4.酶量过多酶量过多5.5.dNTPdNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高6.6.循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策1.1.纯化模板纯化模板2.2.更换更换BufferBuffer3.3.适当提高退火温度适当提高退火
16、温度4.4.适量用酶适量用酶5.5.适当降低适当降低dNTPdNTP和镁离子的和镁离子的浓度浓度6.6.减少循环次数减少循环次数 拖尾 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况（筛选转基因、检测基因表达情况)原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染 现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物 对策：1.1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.2.除除酶酶及及不不能能耐耐高高温温的的物物质质外外，所所有有试试剂剂或或器器材材均均应应高高压压消消毒毒。所所用用离离心心管管及加样枪头等均应一
17、次性使用。及加样枪头等均应一次性使用。3.3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。（一）防止污染（一）防止污染试剂小量分装试剂小量分装吸头及吸头及EP管一次性使用管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照（二）设立对照阳性对照：阳性对照：阳性模板阳性模板阴性对照：阴性对照：阴性模板阴性模板试剂对照：试剂对照：除模板外的所有组分除模板外的所有组分注意的事项注意的事项：PCR的类型及应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标
18、本分析肿瘤各种肿瘤检测其他PCR的不同类型的不同类型重组重组PCR 不对称不对称PCR 反向反向PCR 多重多重PCR原位原位PCR 连接酶链反应连接酶链反应巢式巢式PCR 递减递减PCR热启动热启动PCR RTPCR 实时定量实时定量PCR 重组PCR（基因克隆）重组重组DNADNA质粒质粒DNADNA基因片段基因片段55Bam H IBam H IBam H IBam H IBam H IBam H IBam H IBam H IG GT TC CC CG GG GA AC CC CC CT TG GC CA AG GG GG GT TC CC CG GG GA AC CC CC CT T
19、G GC CA AG GG GCCTGCCTGGGACGGACGTCCGTCCCAGGCAGG质粒质粒DNADNA目的基因目的基因限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链目的：扩增产生特异长度的单链DNADNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物物和非限制性引物,其最佳比例一般是其最佳比例一般是0.010.5M,0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针制备杂交探针 基因组基因组DNADNA
20、结构功能的研究结构功能的研究 高浓度引物低浓度引物反向反向PCR(reverse PCR)PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNADNA片片段对某个已知段对某个已知DNADNA片段两侧的未知序列进行扩增。片段两侧的未知序列进行扩增。可可对对未未知知序序列列扩扩增增后后进进行行分分析析,如如探探索索邻邻接接已已知知DNADNA片片段段的的序序列列；用用于于仅仅知知部部分分序序列列的的全全长长cDNAcDNA的的克克隆隆,扩扩增增基基因因文文库库的的插插入入DNADNA；建建立立基基因因组组步步移移文文库。库。已知序列已知序列未
21、知序列未知序列未知序列未知序列已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶多重PCR用于检测特定基因序列的存在或缺失。用于检测特定基因序列的存在或缺失。电电电电泳泳泳泳引物引物原位 原位聚合酶链式反应（原位聚合酶链式反应（In Still PCRIn Still PCR，IsIsPCRPCR）是由）是由HaaseHaase等于等于19901990年首创。它是利用完整的年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检片段，在不破
22、坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。中进行扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列适用于检测病理切片中含量较少的靶序列操作步骤固定组织或细胞固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶.蛋白酶蛋白酶K K消化处理消化处理:用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55消化处理2h后，962min以灭活蛋白酶K.PCRPCR扩增扩增:在组织细
23、胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置.杂交杂交:PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交 原位PCR的作用 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISHISH），），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于1010的情况下，该方的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的法的敏感度就明显下降。而标准的PCRPCR则可扩增出细胞内单则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相拷贝的序列，敏感度很高，
24、但却未能与细胞形态学研究相结合。结合。ISPCR ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内内基因重排、以及分析细胞内RNARNA表达产物等方面发挥一定表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。人类染色体端粒人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片的荧光原位杂交照片 LCRLCR连接酶链反应连接酶链反应 LCR（Ligase chain reacti
25、on）基本原理为利用DNA连接酶.特异地将双链DNA片段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增.若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物.LCR的引物是两对分别互补的引物，引物长度为2026个，以保证引物与靶序列的特异性结合，其特异性首先取决于引物与模板的特异性结合，其次是耐热连接酶的特异性.LCR连接反应温度接近寡苷酸的解链温度(Tm)，因而识别单核苷酸错配的特异性极高.LCR的扩增效率与PCR相当，用耐热连接酶做LCR只用两个温度循环，94min变性和65复性并连接，循环30次左右
26、目前该方法主要用点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等.LP（Labelled primers)检测 利用同位素、荧光素等对引物进行标记，利用同位素、荧光素等对引物进行标记，用以直观地检测目的基因。用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分可同时检测多种基因成分病毒病毒1 1 病毒病毒2 2 病毒病毒 3 3 病毒病毒4 4标记引物标记引物标记引物标记引物观察观察PCRPCR产物产物巢式巢式PCRPCR（Nest-PCRNe
27、st-PCR）P1P2P3P4 巢式巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。套引物都互补的靶序列很少。巢巢式式PCR可可以以增增加加有有限限量量靶靶序序列列（如如稀稀有有mRNA）的的灵灵敏敏度度，并且提高了困难并且提高了困难PCR（如如5 RACE）的特异性。）的特异性。递减递减PCRPCR（TouchDown PCRTouchDown PCR）递递减减PCR通通过过在在PCR的的前前几几个个循循环环使使用用严严谨谨的的退退火火条条件件提提高高特特异异性性。循循环环设设在在比比估估算算的的TmTm高高大大约约
28、5的的退退火火温温度度下下开开始始，然然后每个循环降低后每个循环降低1 1-2 2,直到退火温度低于直到退火温度低于Tm Tm 5。特特异异性性最最高高的的目目的的模模板板会会被被优优先先扩扩增增，这这些些产产物物在在随随后后的的循循环中继续扩增占据优势。环中继续扩增占据优势。递递减减PCR对对于于那那些些不不了了解解引引物物和和目目的的模模板板同同源源性性程程度度的的方方法更为有用，如法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。指纹分析等。热启动热启动PCR PCR（HotStart PCRHotStart PCR）热热启启动动主主要要是是通通过过抑抑制制一一种种基基本本成成分分延延迟迟DNA
29、合合成成，直到直到PCR 仪达到变性温度；仪达到变性温度；现现在在有有很很多多公公司司都都有有HotStart Taq酶酶出出售售，该该酶酶具具有有热热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用；热热启启动动PCR是是除除了了好好的的引引物物设设计计之之外外，提提高高PCR特特异异性性最重要的方法之一。最重要的方法之一。RT-PCRRNARNA的多聚酶反应（的多聚酶反应（RT-PCRRT-PCR）是以）是以RNA RNA 为模板，为模板，联合逆转录反应（联合逆转录反应（r reverse everse t transcriptionranscripti
30、on，RTRT）与与PCRPCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于1010个拷贝的个拷贝的RNARNA模板模板。RNARNA扩增步骤：扩增步骤：在在单引物单引物的介导下和的介导下和逆转录酶逆转录酶的催化下，合成的催化下，合成RNARNA的互补的互补cDNAcDNA加热后加热后cDNAcDNA与与RNARNA链解离，然后与另一引物退火，链解离，然后与另一引物退火，并由并由DNADNA聚合酶聚合酶催化引物延伸生成双链靶催化引物延伸生成双链靶DNADNA最后扩增靶最后扩增靶DNADNART-PCR逆转录酶聚合酶RNARNA杂合双链杂合双链PCR扩增RNAcDNA
31、反转录引物反转录引物逆转录酶：逆转录酶：1.禽类成髓细胞病毒禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶，活性包括依赖于逆转录酶，活性包括依赖于RNA的的DNA合成，依赖于合成，依赖于DNA的的 DNA合成以及对合成以及对DNA:RNA杂交体杂交体的的RNA部分进行内切降解部分进行内切降解(RNA酶酶H活性活性)。2.鼠白血病病毒鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。反转录酶。MLV反转录酶兼备依赖于反转录酶兼备依赖于RNA和依赖于和依赖于DNA的的DNA合成活性，但降解合成活性，但降解RNADNA杂交体中的杂交体中的RNA的能力较弱。的能力较弱。3.普通逆转录酶反应温度为普通逆转录酶反应温度为37-42度，
32、所以反转录的延伸温度一度，所以反转录的延伸温度一般都是般都是37或或42 。逆转录反应的一般步骤逆转录反应的一般步骤1.RNA模板模板+反转录引物，反转录引物，70，5min,冰浴冰浴1min。2.再加以下反应组分：再加以下反应组分：Buffer dNTP 逆转录酶抑制剂逆转录酶抑制剂 逆转录酶逆转录酶3.以上组分加好后，混匀，以上组分加好后，混匀，42或或37 60min。4.70，5min 后再冰浴，所得产物就是后再冰浴，所得产物就是cDNA，cDNA用做后面的用做后面的PCR的模板。的模板。一步法：一步法：利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆
33、转录酶、引物、Taq酶、酶、4种种dNTP 直接进行直接进行mRNA反转录与反转录与PCR扩增。发现扩增。发现Taq酶不仅具有酶不仅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在同一体系中直接以同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后为模板进行反转录和其后PCR扩增，从而扩增，从而使使mRNA的的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度，临床步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于中小于1ng的低丰度的低丰度m
34、RNA。该法可用于低丰度。该法可用于低丰度mRNA的的cDNA文库的构建及文库的构建及特异特异cDNA的克隆，并有可能与的克隆，并有可能与Taq酶的测序技术相组合，使得自动酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。两步法：两步法：由于单管反应时由于单管反应时RT和和PCR都不能在最佳条件下进行并且都不能在最佳条件下进行并且 容易相互干扰，常只适宜用基因特异引物扩增较短的基容易相互干扰，常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因，及定量因，及定量PCR。两步法则是将。两步法则是将RT和和PCR分别进行，这分别进行，这
35、样使得两个反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严样使得两个反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严谨，适合那些谨，适合那些GC含量、二级结构严重的模板或者是未知含量、二级结构严重的模板或者是未知模板，以及多个基因的模板，以及多个基因的RT-PCR。二二、测序原理、测序原理 双脱氧核苷酸终止测序法（也叫sanger测序法）的原理是：在PCR体系中加入双脱氧核苷酸（ddNTP），在PCR延伸过程中ddNTP随机掺入到合成链中从而导致延伸的终止，经过大量的这样随机终止的PCR反应，生成一系列长度相差1个碱基的PCR产物混合物，此产物通过电泳根据不同长度片段的电泳速度不同来检测整段DNA的序列。dNTP
36、与与ddNTP双脱氧终止法示意普普通通dNTP dNTP 33端端羟羟基基在在聚聚合合酶酶作作用用下下与与下下一一碱碱基基55端端磷磷酸酸基基团团结结合合形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键，DNADNA链链得得以以延伸延伸ddNTPddNTP被被 去去 掉掉 33端端羟羟基基，无无法法与与后后继继的的dNTPdNTP结结合合形形成成磷磷酸酸 二二 酯酯 键键，所所 以以DNADNA链被终止链被终止O碱基碱基CPOHH12345OHO碱基碱基CPOHH12345双脱氧终止法示意脱氧核苷酸脱氧核苷酸（dNTP）的连接的连接O碱基碱基CPOHH12345OHO碱基碱基CPOH12345HDNA聚合酶聚合酶
37、双脱氧终止法示意脱氧核苷酸（脱氧核苷酸（dNTP）的连接）的连接O碱基碱基CPH12345HDNA聚合酶聚合酶双脱氧终止法示意O碱基碱基CPOHH12345OH双脱氧核苷酸（双脱氧核苷酸（ddNTP）双脱氧终止法测序反应组分模板预备测序的双链或单链DNA引物在模板上已知区域设计的测序引物，引物确定了测序的方向方向和位置位置dNTPddNTP脱去3端羟基的dNTP，并且4种不同的ddNTP上标记有4种不同颜色的荧光标记DNA聚合酶缓冲液为DNA聚合酶提供工作条件模板模板引物引物DNA聚合酶聚合酶测序组分示意图因为颜色不同，4种终止物可以在一起进行反应。测序反应示意图测序反应示意图 在引物延伸反应
38、过在引物延伸反应过程中，程中，dNTP和和ddNTP是是相互竞争相互竞争地掺入到延地掺入到延伸链的伸链的3端的，因而端的，因而ddNTP在不同位置掺入，在不同位置掺入，就产生了一系列不同长就产生了一系列不同长度的新的度的新的DNA片段。片段。测序测序PCR产物电泳分离示意图产物电泳分离示意图 不同片段长度的测不同片段长度的测序产物因大小不同而电序产物因大小不同而电泳速度不同，从小到大泳速度不同，从小到大先后通过测序仪的荧光先后通过测序仪的荧光检测窗口，并根据检测检测窗口，并根据检测的荧光信号颜色来读取的荧光信号颜色来读取通过片段的末端的碱基通过片段的末端的碱基序列，一系列相差序列，一系列相差1
39、个个碱碱基的片段依次通过，则基的片段依次通过，则就可以读出整个模板片就可以读出整个模板片段的序列。段的序列。测序仪基本构造示意图1 电进样及电泳电进样及电泳1.毛细管和电极深入样品溶液中2.加电压3.荷负电的DNA分子进入毛细管 在电场作用下向阳极泳动2 荧光激发和检测荧光激发和检测1.分别带4色荧光标记的DNA片段从小到大依次经过激光检测区2.激光激发荧光产生长波长的荧光信号3.荧光信号被冷CCD收集4.软件将光学信号转换成电泳图谱 76PCR扩增与扩增与DNA测序反应的区别测序反应的区别类型类型PCR测序反应测序反应PCR产物增加方式产物增加方式指数指数线性线性模板量模板量少少多多引物引物一对一对一个一个dNTPdNTP有有有有ddNTPddNTP无无有，带荧光标记有，带荧光标记酶酶TaqTaq酶酶测序酶（测序酶（T7 DNAT7 DNA聚合酶）聚合酶）退火温度退火温度根据引物退火温度而定根据引物退火温度而定5050度度退火时间退火时间根据片段大小而定根据片段大小而定固定固定延伸温度延伸温度7272度度6060度度延伸时间延伸时间根据片段大小而定根据片段大小而定固定固定产物大小产物大小长度一致长度一致相差一个碱基的一系列片段相差一个碱基的一系列片段
