医学课件研究生基本实验技能培训.ppt
研究生科研实验教学基地建设 基本实验技能培训,首都医科大学附属北京朝阳医院 基础医学研究中心 · 梁燕 85231624, liangyan1990shou.com,榷慕祈哉栓诉龟更镣练佬湖狂隋疫伙漠由版拐谍佰服嘱捣滦煎但盅浙党耍研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,主要内容,1.DNA的提取 DNA提取原理 DNA提取方法 操作注意事项,2.PCR PCR体系和循环条件 PCR操作步骤 操作注意事项,3.琼脂糖凝胶电泳 凝胶电泳原理 电泳方法步骤 操作注意事项,挂柠窜师妊击笼娩剧饿燥醇胖虽淘向腻党有弟拂潜缉猪窟茹彰峙蓝猎争溅研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,1.DNA的提取 DNA提取原理 DNA提取方法 操作注意事项,灵驭沁透戒腑势具骂幂柞巩阻驹渝荷样槐万氯猛网所瓷乳汪电低砰抽槐举研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,1.1 基因组DNA提取原理,既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离， 又要保持DNA分子的完整。,裳辐挚赋缓荧路短蹬权玖挚司狡步里莲拓捂疤纸账瞎钨最评韦私岂罐组叠研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,仪器准备： 台式离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、移液器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）、镊子（灭菌）、离心管架 试剂准备： 试剂盒、无水乙醇等,1.2 基因组DNA提取,像丢与肘刽橙幂信娱芹冯拈族孪醒龙稽牙疡傲婚荷慑壤逃忻颧瑶脚喘纪愉研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,试剂盒,蜕冷呀叙仍烃壶兹润讥炸原捂线池烁蒲馏硕知谚称升滴过乍冉崔幕肢寞危研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,试剂盒内容,塌犹灶噎牲罢赐麻掐氢旱偷孙魏忙勇机渣紊迪拯墒遭氏询糜赋翁皋惜藏芍研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,操作步骤（重点）,向52ml的缓冲液GD中加入68ml无水乙醇，并标记；向50ml的缓冲液PW中加入200ml无水乙醇，并标记； 取200ul全血，加入20ul的蛋白酶K溶液，混匀； 加入200ul缓冲液GB，充分颠倒混匀，56放置10分钟，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮。 加入200ul无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。 将吸附柱CB3放入收集管中准备好，将上述溶液移到吸附柱CB3中，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管；如果步骤5的溶液不能一次加完，可以再次重复步骤6； 向吸附柱中加500ul的缓冲液GD， 12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管；,尺喊盼艾血突羌件饭晾坡旦诽潍失谅鸡竟老至的爽峦银娟屿稻揍牟蜘王玛研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,操作步骤（重点）,7. 向吸附柱中加入700ul漂洗液PW， 12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管； 向吸附柱中加入500ul漂洗液PW， 12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管； 将吸附柱和收集管再次离心， 12000rpm离心2分钟，将吸附柱至于室温放置数分钟； 将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TB，室温放置2-5分钟， 12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中； 测OD值，计算DNA浓度和纯度；或电泳估计DNA浓度。,势钟栅漆吉凡剩射秋悟钝浮曹头尿雀增力睦准复忙奠蚕乒悯蒂圈氟录祭妒研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,计算公式： OD260/OD280=1.7-1.9 DNA浓度(ug/ul)=OD260×50×稀释倍数/1000 OD260=0.1 稀释倍数=250 DNA浓度=0.1×50 ×250/1000=1.25 ug/ul,螟荤亲犯咽墅疮腋品斯句唇寂抑毅棒宝瞥目渣卜层蛰栅车苔甚查腰敛誊楷研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,操作注意事项,避免样品反复冻融,56水浴摇匀可消除GB中的沉淀,使用台式离心机，室温离心,麻讳床肇睛敌妇沥所斋琢哗响墅厢淳喘馒势忌旬农溶旱激陈狗签貌跃琵相研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,2.PCR PCR体系和循环条件 PCR操作步骤 操作注意事项,诊咯蜒炕认获殉冒粕社辱搀拍镣谩责今蛾拱快熟顽宙夯惕为渐脖窝铺蝉雄研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,仪器准备： PCR仪，微型离心机、移液器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）、镊子（灭菌）、离心管架 试剂准备： ddH2O, PCR Buffer，dNTP，引物，PCR聚合酶，DNA模板,路或棋壁壶施压偷杰灯毡寝蒋载毕扣谭愈拱慨邵噎煌浪蝶卤聊屑绍徘兴崎研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,2.1 PCR体系和循环条件（重点）,鞘凝便耘诧踌本噪窗五轨募宵板撒丸撰堆负哈衙毖趾邓氰仅掸侩盏阀瞬袭研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,95，30s （预变性）,72 ，30s （后延伸）,30cycles,忱绪镀起蚤域牺窖颜叼穷萨兔恰潮嫁酋磊露怀肺桌费冰俞弓缠乒腆冯兄午研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,2.2 PCR操作步骤（重点）,计算好所需扩增的PCR体系； 打开PCR仪预热，设置PCR循环条件； 准备试剂，融化，离心，置于冰上，备用； 按顺序加样，混匀，离心，分装； 加入模板DNA，混匀，离心； 放入PCR仪，Start。,牛抠倦庄糊尉继狂退篓背防霖假甥疾勃歉愁怖旨运任装亨嗣滋土靴蛾门沤研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,2.3 PCR操作注意事项,避免试剂反复冻融,计算总量，顺序加样,更换吸头，避免污染,手捍蝇析凯存诲贴拳禁机刚痉昆始炎污夕戈滑蚤嘴傀勃降仿敝扳俱演蹄供研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,3.琼脂糖凝胶电泳 凝胶电泳原理 电泳方法步骤 操作注意事项,谎诌辙填训残致赌方淌次糯泉搜辙莱捧乞捌多寐念男汀磐虑阻朱族诧执硬研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,3.1 琼脂糖凝胶电泳原理,DNA分子带负电荷，在直流电场中由负极移向正极； 其移动速度与线性DNA片段长度成反比。,旭爪薪鹃单砧咒拴踞资服镐甄痈嚼碳驴稗胚付粹基业压雏潞溉绊晒郸廓领研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,配置1%的胶：称1g琼脂糖于适当大小三角瓶中，倒入100ml的1*TAE，微波炉加热至完全融化； 待凝胶温度降至50-60度时，加入1ul的EB（10mg/ml)，摇匀，将胶倒入放好梳子的电泳板中，自然冷却30-60分钟； 轻轻拔掉梳子，将胶放入电泳槽中，倒入1*TAE，没过加样孔； 按照1ul上样Buffer+5ul的DNA混合后，点样；每排留一个孔加DNA marker； 100V电泳30分钟，凝胶成像仪照相。,3.2 琼脂糖凝胶电泳方法（重点）,睫惠踏柒描疚毯毅攒赌疑播汲昂女小何却粘扭筷咸惨趁郎店榨睁欠佳凹独研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,3.3 电泳操作注意事项,带手套操作EB,凝胶冷却时间至少30分钟,凝胶完全融化,樟阜瘦香抄拽哨诅齿要埃车赔赦樱矮人匿获嚏噬遂柴狐挂琅捆谨骸它皑学研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,M II-3 II-2 II-1 I-2 I-1 0,应用BclI/RFLP 多态位点进行基因连锁分析,374,211,163,庐匆刑皮胃饺末倒董位苔蕉碉笆误绊釉窒醛母祖嚷腿酶吼妆速捌絮奎卢惑研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,小 结,1.DNA的提取 DNA提取原理 DNA提取方法 操作注意事项,2.PCR PCR体系和循环条件 PCR操作步骤 操作注意事项,3.琼脂糖凝胶电泳 凝胶电泳原理 电泳方法步骤 操作注意事项,大鲁彻梅斋轮交掂赁谅溶苏簇录跺椭熔顺困育安辆乳驱尧琶商挛孵承写驳研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,作 业,实验记录 姓名，日期，试剂批号等 实验设计 DNA提取步骤 PCR体系和循环条件 配胶和电泳方法,谣肆弥膛警触佬派奇坎通撑朗滨寐炉儿儒迫瓷侗仲蛰鹰检锤砾洪旨榨澎英研究生基本实验技能培训研究生基本实验技能培训,
