1、Real Time PCR）实时荧光定量PCR介绍主要内容主要内容 Real Time PCR Real Time PCR 基础知识基础知识 Real Time PCR Real Time PCR 实验方法实验方法 Real Time PCR Real Time PCR 解析方法解析方法 Real Time PCR Real Time PCR 应用实例应用实例Real Time PCR Real Time PCR 基础知识基础知识 Real Time PCR Real Time PCR 的用途及原理的用途及原理 Real Time PCR Real Time PCR 检测方法检测方法 Rea
2、l Time PCR Real Time PCR 检测系统检测系统差异显示结果验证差异显示结果验证差异显示结果验证差异显示结果验证 定性分析定性分析定性分析定性分析绝对定量绝对定量绝对定量绝对定量相对定量相对定量相对定量相对定量病毒和病原菌检测病毒和病原菌检测病毒和病原菌检测病毒和病原菌检测基因芯片结果验证基因芯片结果验证基因芯片结果验证基因芯片结果验证siRNAsiRNAsiRNAsiRNA效果确认效果确认效果确认效果确认mRNAmRNAmRNAmRNA表达量分析表达量分析表达量分析表达量分析Real Time PCR Real Time PCR Real Time PCR Real Tim
3、e PCR 用途用途用途用途操作简单，无需电泳，检测快速，降低污染几率，操作简单，无需电泳，检测快速，降低污染几率，操作简单，无需电泳，检测快速，降低污染几率，操作简单，无需电泳，检测快速，降低污染几率，适用于大量样品检测，检测灵敏度高；适用于大量样品检测，检测灵敏度高；适用于大量样品检测，检测灵敏度高；适用于大量样品检测，检测灵敏度高；可以在宽广范围内进行准确定量。可以在宽广范围内进行准确定量。可以在宽广范围内进行准确定量。可以在宽广范围内进行准确定量。生物品种鉴定生物品种鉴定生物品种鉴定生物品种鉴定病毒和病原菌定量分析病毒和病原菌定量分析病毒和病原菌定量分析病毒和病原菌定量分析导入基因拷贝
4、数解析导入基因拷贝数解析导入基因拷贝数解析导入基因拷贝数解析GMOGMOGMOGMO定量检测定量检测定量检测定量检测SNPSNPSNPSNP解析解析解析解析激激发发光光发发射射光光CtCt值值Real Time PCR Real Time PCR 原理原理使用使用Real Time PCRReal Time PCR扩增装置实时监测扩增装置实时监测PCRPCR扩增产物并进行分析的方法。扩增产物并进行分析的方法。Real Time PCRReal Time PCR同一个样品重复同一个样品重复9696次次PCRPCR的扩增曲线的扩增曲线 Real Time PCR Real Time PCR 原理原
5、理CtCt值值 Real Time PCR Real Time PCR扩增过程中，每个反应管内的扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。(C-(C-代表代表CycleCycle，t-t-代表代表thresholdthreshold）CtCt值概念值概念阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上 设定的荧光检出界限。设定的荧光检出界限。Real Time PCR Real Time PCR 原理原理在在PCRPCR反应体系中加入荧光物质，并实时监测荧光信号积累的整个反应体系中加入荧光物质，
6、并实时监测荧光信号积累的整个PCRPCR进程，进程，最后通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析。最后通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析。Real Time PCR Real Time PCR 原理原理Real Time PCR Real Time PCR 基础知识基础知识 Real Time PCR Real Time PCR 的用途及原理的用途及原理 Real Time PCR Real Time PCR 检测方法检测方法 Real Time PCR Real Time PCR 检测系统检测系统REAL TIME PCRREAL TIME
7、PCR检测方法检测方法 荧光染料嵌合法荧光染料嵌合法(SYBR Green I)(SYBR Green I)荧光探针法荧光探针法 TaqManTaqMan probe probe Cycling probe Cycling probe Molecular Beacon probeMolecular Beacon probe Hybridization probe Hybridization probe Scorpions probe Scorpions probe Amplifluor Amplifluor probe probe SYBR Green I SYBR Green I是一种结合于
8、所有是一种结合于所有dsDNAdsDNA双螺旋小沟区域的具双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。有绿色激发波长的染料。荧光染料嵌合法荧光染料嵌合法(SYBR Green I)(SYBR Green I)SYBR Green ISYBR Green ISYBR Green ISYBR Green I荧光染料嵌合法荧光染料嵌合法(SYBR Green I)(SYBR Green I)作用机理示意图作用机理示意图热变性热变性热变性热变性引物退火引物退火引物退火引物退火延伸反应延伸反应延伸反应延伸反应 TaqMan TaqMan探针为一寡核苷酸，探针为一寡核苷酸，5 5端标记一个报告荧光基团端标记一
9、个报告荧光基团(Reporter)(Reporter)，3 3端标记一个淬灭荧光基团端标记一个淬灭荧光基团(Quencher)(Quencher)。TaqManTaqMan Probe Probe法作用机理法作用机理TaqManTaqMan Probe Probe 法作用机理示意图法作用机理示意图热变性热变性热变性热变性引物和探针与模板退火引物和探针与模板退火引物和探针与模板退火引物和探针与模板退火延伸反应延伸反应延伸反应延伸反应探针探针探针探针报告基团报告基团报告基团报告基团淬灭基团淬灭基团淬灭基团淬灭基团探针探针探针探针DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶引物引物引物引物R R
10、R RR RR R Cycling probe Cycling probe为一寡核苷酸，为一寡核苷酸，5 5端标记一个荧光端标记一个荧光报告基团报告基团(Reporter)(Reporter)，3 3端标记一个荧光淬灭基团端标记一个荧光淬灭基团(Quencher)(Quencher)，寡核苷酸为，寡核苷酸为DNA/RNADNA/RNA杂合体。杂合体。QR核糖核苷酸核糖核苷酸Cycling ProbeCycling Probe法法热变性热变性热变性热变性酶切酶切酶切酶切延伸延伸延伸延伸Cycling ProbeCycling Probe法基本原理法基本原理退火退火退火退火SYBR GREEN I
11、法法VS PROBE法法 SYBR Green I 法法 优点：价格便宜、使用方便、优点：价格便宜、使用方便、无需合成特异性探针无需合成特异性探针。缺点：引物缺点：引物要求高（要求特异性扩增）、不能进行多重要求高（要求特异性扩增）、不能进行多重PCRPCR。Probe法法优点：优点：特异性强，能进行多重特异性强，能进行多重PCRPCR。缺点：缺点：需要设计特异性探针，成本高、有时设计困难需要设计特异性探针，成本高、有时设计困难。以前对以前对PCR引物的选择、引物的选择、PCR试剂的优化试剂的优化经验不足，经验不足，Probe法较为广用。法较为广用。但是但是使用使用SYBR GREEN I 进行
12、检测的问题进行检测的问题点点SYBR Green ISYBR Green I与双链与双链DNADNA进行结合后散发荧光，因此如果反进行结合后散发荧光，因此如果反 应体系中有非特异性扩增，非特异性应体系中有非特异性扩增，非特异性DNADNA也将同时被检测，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。从而可能导致检测结果不准确。Primer Primer DimerDimer的产生的产生 二条引物的二条引物的3 3端具有互补序列时，引物自身也会进行扩增，端具有互补序列时，引物自身也会进行扩增，产生短链产生短链DNADNA片段（片段（Primer DimerPrimer Dimer）。）。33555
13、533GATCCTAGGATCCTAG使用使用 SYBR Green I 进行定量进行定量 PCR 的的 Key PointPrimer：设计合适引物，防止非特异性扩增，是设计合适引物，防止非特异性扩增，是使用使用 SYBR Green I SYBR Green I 进行定量进行定量 PCR PCR 的的 Key PointKey Point。TaKaRa公司可以提供公司可以提供最佳引物的设计合成服务最佳引物的设计合成服务REAL TIME 进入进入 SYBR GREEN I 时时代代1.1.设计合适的引物设计合适的引物2.2.选择适当的反应条件选择适当的反应条件3.3.使用良好的试剂使用良好
14、的试剂保证以上条件，使用保证以上条件，使用SYBR Green ISYBR Green I将将会更加便宜，更为方便，并拥有良会更加便宜，更为方便，并拥有良好的特异性。好的特异性。Real Time PCR Real Time PCR 基础知识基础知识 Real Time PCR Real Time PCR 的用途及原理的用途及原理 Real Time PCR Real Time PCR 检测方法检测方法 Real Time PCR Real Time PCR 检测系统检测系统生产厂商生产厂商生产厂商生产厂商 仪器名称仪器名称仪器名称仪器名称 TaKaRaTaKaRaTaKaRaTaKaRa公司
15、公司公司公司TP800TP800TP800TP800Applied BiosystemsApplied BiosystemsApplied BiosystemsApplied Biosystems公司公司公司公司ABI PRISM 7700ABI PRISM 7700ABI PRISM 7700ABI PRISM 7700、7000700070007000、7300730073007300、7900HT7900HT7900HT7900HT、7500Fast7500Fast7500Fast7500FastRocheRocheRocheRoche公司公司公司公司LightCyclerLightCy
16、clerLightCyclerLightCycler 2.0 2.0 2.0 2.0、LightCyclerLightCyclerLightCyclerLightCycler 480 480 480 480 CepheidCepheidCepheidCepheid公司公司公司公司Smart CyclerSmart CyclerSmart CyclerSmart Cycler、Smart Cycler IISmart Cycler IISmart Cycler IISmart Cycler II、Smart Cycler Smart Cycler Smart Cycler Smart Cycle
17、r TD TD TD TD Bio-RadBio-RadBio-RadBio-Rad公司公司公司公司iCycleriCycleriCycleriCycler iQ iQ iQ iQ、iQ5 Real-Time PCR Detection SystemiQ5 Real-Time PCR Detection SystemiQ5 Real-Time PCR Detection SystemiQ5 Real-Time PCR Detection System Corbett ResearchCorbett ResearchCorbett ResearchCorbett Research公司公司公司公司
18、Rotor-gene2000Rotor-gene2000Rotor-gene2000Rotor-gene2000、Rotor-gene3000 Rotor-gene3000 Rotor-gene3000 Rotor-gene3000、Rotor-gene6000Rotor-gene6000Rotor-gene6000Rotor-gene6000 MJ ResearchMJ ResearchMJ ResearchMJ Research公司公司公司公司OpticonOpticonOpticonOpticon、MJ Mini CyclerMJ Mini CyclerMJ Mini CyclerMJ
19、Mini Cycler、MiniOpticonMiniOpticonMiniOpticonMiniOpticonStratageneStratageneStratageneStratagene公司公司公司公司Mx4000Mx4000Mx4000Mx4000 、Mx3000PMx3000PMx3000PMx3000P 、Mx3005PMx3005PMx3005PMx3005PTMTMTMTM杭州博日杭州博日杭州博日杭州博日LINE-GENE FQD-33ALINE-GENE FQD-33ALINE-GENE FQD-33ALINE-GENE FQD-33A、LINE-GENE FQD-66ALI
20、NE-GENE FQD-66ALINE-GENE FQD-66ALINE-GENE FQD-66AReal Time PCRReal Time PCR检测系统检测系统-简介简介LightCyclerLightCyclerLightCyclerLightCycler 480 480 480 480 Rotor-Rotor-Rotor-Rotor-gene6000 gene6000 gene6000 gene6000 MiniOpticon MiniOpticon MiniOpticon MiniOpticon Mx3005PMx3005PMx3005PMx3005PTMTMTMTM LINE-G
21、ENE FQD-LINE-GENE FQD-LINE-GENE FQD-LINE-GENE FQD-66A66A66A66A ABI PRISM 7500ABI PRISM 7500ABI PRISM 7500ABI PRISM 7500 iQ5 Real-Time PCR Detection System iQ5 Real-Time PCR Detection System iQ5 Real-Time PCR Detection System iQ5 Real-Time PCR Detection System TaKaRa TP800TaKaRa TP800TaKaRa TP800TaKa
22、Ra TP800各公司各公司REAL TIME PCRREAL TIME PCR检测系统比较检测系统比较仪器名称仪器名称仪器名称仪器名称反应孔数反应孔数反应孔数反应孔数反应孔间反应孔间反应孔间反应孔间 独立性独立性独立性独立性检出通道检出通道检出通道检出通道升降温速度升降温速度升降温速度升降温速度TubeTubeTubeTubeROXROXROXROX荧光荧光荧光荧光校正功能校正功能校正功能校正功能TaKaRaTaKaRaTaKaRaTaKaRa TP800 TP800 TP800 TP80096969696无无无无2-5 2-5 2-5 2-5 快快快快0.2ml0.2ml0.2ml0.2m
23、l普通普通普通普通TubeTubeTubeTube无无无无ABI7000ABI7000ABI7000ABI700096969696无无无无4 4 4 4快、慢两种快、慢两种快、慢两种快、慢两种0.2ml 80.2ml 80.2ml 80.2ml 8联管、联管、联管、联管、专用专用专用专用CapCapCapCap有有有有ABI7500 FastABI7500 FastABI7500 FastABI7500 Fast5 5 5 5快快快快Light Cycler2.0Light Cycler2.0Light Cycler2.0Light Cycler2.032323232无无无无6 6 6 6快快
24、快快专用毛细玻璃管专用毛细玻璃管专用毛细玻璃管专用毛细玻璃管无无无无Light Cycler 480Light Cycler 480Light Cycler 480Light Cycler 48096 or 38496 or 38496 or 38496 or 3845 5 5 5快快快快专用板专用板专用板专用板Smart Cycler Smart Cycler Smart Cycler Smart Cycler 16(616(616(616(616)16)16)16)有有有有4 4 4 4快快快快专用、塑料石英专用、塑料石英专用、塑料石英专用、塑料石英无无无无Rotor-Gene 3000R
25、otor-Gene 3000Rotor-Gene 3000Rotor-Gene 300036(0.2ml)36(0.2ml)36(0.2ml)36(0.2ml)72(0.1ml)72(0.1ml)72(0.1ml)72(0.1ml)无无无无4 4 4 4慢慢慢慢 0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml为普通为普通为普通为普通Tube,Tube,Tube,Tube,0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml为专用为专用为专用为专用TubeTubeTubeTube无无无无MiniOpticonMiniOpticonMiniOpticonMiniOpticon48484848无无无无2 2 2 2快
26、快快快0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml普通普通普通普通TubeTubeTubeTube无无无无iQ5 Real-Time PCRiQ5 Real-Time PCRiQ5 Real-Time PCRiQ5 Real-Time PCR Detection System Detection System Detection System Detection System 96969696无无无无5 5 5 5快快快快0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml普通普通普通普通TubeTubeTubeTube无无无无LINE-GENE LINE-GENE LINE-GENE LINE-GENE F
27、QD-66AFQD-66AFQD-66AFQD-66A66666666无无无无4 4 4 4快快快快0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml普通普通普通普通TubeTubeTubeTube无无无无Mx3000PMx3000PMx3000PMx3000P 96969696无无无无4 4 4 4慢慢慢慢0.2ml 80.2ml 80.2ml 80.2ml 8联管联管联管联管或单管或单管或单管或单管有有有有Mx3005PMx3005PMx3005PMx3005PTMTMTMTM5 5 5 5 Real Time PCR Real Time PCR 基础知识基础知识 Real Time PCR Rea
28、l Time PCR 实验方法实验方法 Real Time PCR Real Time PCR 解析方法解析方法 Real Time PCR Real Time PCR 应用实例应用实例 Real Time PCR Real Time PCR 相关试剂与服务相关试剂与服务主要内容主要内容REAL TIME PCR REAL TIME PCR 实验方法实验方法Real Time RT-PCRReal Time RT-PCR反应反应以以RNARNA为起始实验材料时。为起始实验材料时。Real Time PCRReal Time PCR反应反应以以DNADNA为起始实验材料时。为起始实验材料时。RE
29、AL TIME PCR REAL TIME PCR 实验方法实验方法反转录反应反转录反应One Step RT-PCROne Step RT-PCR和和Two Step RT-PCRTwo Step RT-PCR的选择的选择RT PrimerRT Primer的选择的选择Total RNATotal RNA中中genomic DNAgenomic DNA混入的对策混入的对策Real Time PCRReal Time PCR反应反应Real Time PCRReal Time PCR引物及探针的设计引物及探针的设计引物反应性确认引物反应性确认PCRPCR条件优化顺序条件优化顺序One Step
30、 RT-PCR One Step RT-PCR 和和 Two Step RT-PCRTwo Step RT-PCR的选择的选择Two Step RT-PCRTwo Step RT-PCRTwo Step RT-PCRTwo Step RT-PCROne Step RT-PCROne Step RT-PCROne Step RT-PCROne Step RT-PCRcDNAcDNAcDNAcDNA分装分装分装分装适用于适用于适用于适用于mRNAmRNAmRNAmRNA表达量解析表达量解析表达量解析表达量解析 Two Step RT-PCRTwo Step RT-PCRTwo Step RT-PC
31、RTwo Step RT-PCR效率高效率高效率高效率高 使用使用使用使用RandomRandomRandomRandom和和和和Oligo-dTOligo-dTOligo-dTOligo-dT 引物可以制备引物可以制备引物可以制备引物可以制备cDNAcDNAcDNAcDNA pool pool pool pool cDNA cDNA cDNA cDNA可长期保存可长期保存可长期保存可长期保存适用于病毒、病原菌检测适用于病毒、病原菌检测适用于病毒、病原菌检测适用于病毒、病原菌检测 操作简单操作简单操作简单操作简单 污染几率低污染几率低污染几率低污染几率低 Random 6mer PrimerR
32、andom 6mer PrimerRandom 6mer PrimerRandom 6mer Primer Oligo dT PrimerOligo dT PrimerOligo dT PrimerOligo dT Primer Gene Specific Primer Gene Specific Primer Gene Specific Primer Gene Specific PrimerRT PrimerRT Primer的选择的选择Random 6mer PrimerRandom 6mer PrimerRandom 6mer PrimerRandom 6mer PrimerGene s
33、pecific PrimerGene specific PrimerGene specific PrimerGene specific PrimerOligo dT PrimerOligo dT PrimerOligo dT PrimerOligo dT PrimerRT PrimerRT Primer的选择的选择Random 6merRandom 6merRandom 6merRandom 6mer1,500base1,500base1,500base1,500base目的片段目的片段目的片段目的片段5 5 5 53 3 3 3R R R RF F F F目的片段在目的片段在目的片段在目的片
34、段在mRNAmRNAmRNAmRNA任何位置都能任何位置都能任何位置都能任何位置都能使用。通常使用。通常使用。通常使用。通常mRNAmRNAmRNAmRNA表达量分析最表达量分析最表达量分析最表达量分析最适适适适。目的片段在距目的片段在距目的片段在距目的片段在距Poly(A)Tail Poly(A)Tail Poly(A)Tail Poly(A)Tail 1.5kbp1.5kbp1.5kbp1.5kbp以内适用以内适用以内适用以内适用。One Step RT-PCROne Step RT-PCROne Step RT-PCROne Step RT-PCR只能使用只能使用只能使用只能使用Gene
35、 specific PrimerGene specific PrimerGene specific PrimerGene specific Primer，不适用于不适用于不适用于不适用于mRNAmRNAmRNAmRNA表达量分析等复表达量分析等复表达量分析等复表达量分析等复数基因的检出。数基因的检出。数基因的检出。数基因的检出。5 5 5 53 3 3 3Gene specific PrimerGene specific PrimerGene specific PrimerGene specific Primer目的片段目的片段目的片段目的片段R R R RF F F FAAAAAAAAAAA
36、A A A A A5 5 5 53 3 3 3目的片段目的片段目的片段目的片段R R R RF F F F1,500base1,500base1,500base1,500baseOligo dT PrimerOligo dT PrimerOligo dT PrimerOligo dT PrimermRNAmRNAmRNAmRNAPrimer FPrimer FPrimer FPrimer FPrimer RPrimer RPrimer RPrimer R目的片段目的片段目的片段目的片段RT-PCRRT-PCRRT-PCRRT-PCR外显子外显子外显子外显子1 1 1 1基因组基因组基因组基因组
37、DNADNADNADNAPCRPCRPCRPCR外显子外显子外显子外显子2 2 2 2外显子外显子外显子外显子3 3 3 3外显子外显子外显子外显子1 1 1 1外显子外显子外显子外显子2 2 2 2外显子外显子外显子外显子3 3 3 3内含子内含子内含子内含子2 2 2 2内含子内含子内含子内含子1 1 1 1Primer FPrimer FPrimer FPrimer FPrimer RPrimer RPrimer RPrimer R目的片段目的片段目的片段目的片段Total RNATotal RNA中中Genomic DNAGenomic DNA混入的对策混入的对策此种情况必须采用此种情
38、况必须采用此种情况必须采用此种情况必须采用DNaseDNaseDNaseDNase I I I I处理，去除基因组处理，去除基因组处理，去除基因组处理，去除基因组DNADNADNADNAmRNAmRNAmRNAmRNA基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA目的片段目的片段目的片段目的片段RT-PCRRT-PCRRT-PCRRT-PCR外显子外显子外显子外显子1 1 1 1外显子外显子外显子外显子2 2 2 2外显子外显子外显子外显子3 3 3 3Primer FPrimer FPrimer FPrimer FPrimer RPrimer RPrimer RPrimer RPrimer
39、 FPrimer FPrimer FPrimer FPrimer RPrimer RPrimer RPrimer RPCRPCRPCRPCR长的扩增片段长的扩增片段长的扩增片段长的扩增片段无扩增片段无扩增片段无扩增片段无扩增片段外显子外显子外显子外显子1 1 1 1外显子外显子外显子外显子2 2 2 2外显子外显子外显子外显子3 3 3 3内含子内含子内含子内含子2 2 2 2内含子内含子内含子内含子1 1 1 1Total RNATotal RNA中中Genomic DNAGenomic DNA混入的对策混入的对策引物设计可以避免基因组引物设计可以避免基因组引物设计可以避免基因组引物设计可以
40、避免基因组DNADNADNADNA来源的来源的来源的来源的TemplateTemplateTemplateTemplate扩增扩增扩增扩增目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。体要求不严格。目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。性反应和引物二聚体要求严格。Real Time PCRReal Time PCR用引物与普通用引物与普通PCRPCR引物设计要求不同引物设计要求不同=对引物设计要求严格对引物设计要求严格普通普通PCRPCR引物引物Real Tim
41、e PCRReal Time PCR引物引物Real Time PCRReal Time PCR引物及探针设计引物及探针设计扩增片段大小扩增片段大小扩增片段大小扩增片段大小 80-150bp(80-150bp(80-150bp(80-150bp(尽量限制在尽量限制在尽量限制在尽量限制在300bp300bp300bp300bp以内以内以内以内)PrimerPrimerPrimerPrimer长度长度长度长度17-25base17-25base17-25base17-25baseGCGCGCGC含量含量含量含量40-60%(40-60%(40-60%(40-60%(最好最好最好最好45-55%)4
42、5-55%)45-55%)45-55%)TmTmTmTm值值值值 两条引物的两条引物的两条引物的两条引物的TmTmTmTm值尽量接近，引用专用软件计算值尽量接近，引用专用软件计算值尽量接近，引用专用软件计算值尽量接近，引用专用软件计算TmTmTmTm值值值值序列序列序列序列 整体上碱基不能过偏整体上碱基不能过偏整体上碱基不能过偏整体上碱基不能过偏 个别部分避免个别部分避免个别部分避免个别部分避免GC richGC richGC richGC rich或或或或AT rich(AT rich(AT rich(AT rich(特别是特别是特别是特别是3 3 3 3端端端端)避免避免避免避免T/CT/
43、CT/CT/C连续，连续，连续，连续，A/GA/GA/GA/G连续连续连续连续3 3 3 3末端序列末端序列末端序列末端序列 3 3 3 3末端避免末端避免末端避免末端避免GC richGC richGC richGC rich或或或或AT richAT richAT richAT rich 3 3 3 3末端碱基最好为末端碱基最好为末端碱基最好为末端碱基最好为G G G G 或或或或C C C C 3 3 3 3末端碱基尽量避免为末端碱基尽量避免为末端碱基尽量避免为末端碱基尽量避免为T T T T互补性互补性互补性互补性 引物内部或两条引物之间避免引物内部或两条引物之间避免引物内部或两条引物
44、之间避免引物内部或两条引物之间避免3base3base3base3base以上的互补序列以上的互补序列以上的互补序列以上的互补序列 引物引物引物引物3 3 3 3末端避免末端避免末端避免末端避免2base2base2base2base以上的互补序列以上的互补序列以上的互补序列以上的互补序列特异性特异性特异性特异性 使用使用使用使用BLASTBLASTBLASTBLAST检索，确认引物特异性检索，确认引物特异性检索，确认引物特异性检索，确认引物特异性RT-PCRRT-PCRRT-PCRRT-PCR用引物用引物用引物用引物尽量在尽量在尽量在尽量在ExonExonExonExon junction
45、junction junction junction上设计引物，限制基因组上设计引物，限制基因组上设计引物，限制基因组上设计引物，限制基因组DNADNADNADNA扩增扩增扩增扩增Real Time PCRReal Time PCR用引物设计原则用引物设计原则号表示重要程度，号表示重要程度，号表示重要程度，号表示重要程度，号越多，表示该参数越重要，设计时要优先考虑号越多，表示该参数越重要，设计时要优先考虑号越多，表示该参数越重要，设计时要优先考虑号越多，表示该参数越重要，设计时要优先考虑 目的基因序列获得目的基因序列获得目的基因序列获得目的基因序列获得好的引物好的引物需要寻找好的参照序列需要寻
46、找好的参照序列引物设计引物设计引物设计引物设计分析序列分析序列分析序列分析序列特异性确认特异性确认特异性确认特异性确认基因组序列确认基因组序列确认基因组序列确认基因组序列确认RefSeqRefSeq序列序列目的基因目的基因目的基因目的基因Real Time PCRReal Time PCR引物及探针设计引物及探针设计Real Time RT-PCRReal Time RT-PCRReal Time RT-PCRReal Time RT-PCR引物引物引物引物（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq）通过通过NCBINCBI获得参考序列和相关情报。获得参考序列和相关情
47、报。RefSeqRefSeq数据库提供无重复，准确性，数据库提供无重复，准确性，完整性的基因参考序列。完整性的基因参考序列。序列可信度高，信息量大序列可信度高，信息量大序列可信度高，信息量大序列可信度高，信息量大NCBI:The National Center for Biotechnology Information NM_008777RefSeq评价评价PahPahPahPahX51942 BC013458 BI330290BF789560X51942 BC013458 BI330290BF789560PahPahGenBankReal Time PCRReal Time PCR引物及探针
48、设计引物及探针设计NCBINCBINCBINCBI提供目的基因相关信息提供目的基因相关信息提供目的基因相关信息提供目的基因相关信息（基因名基因名基因名基因名、染色体上的位置染色体上的位置染色体上的位置染色体上的位置、AccessionAccessionAccessionAccession、表表表表现型、现型、现型、现型、文献索引文献索引文献索引文献索引、同源性等其他数据库同源性等其他数据库同源性等其他数据库同源性等其他数据库以及功能以及功能以及功能以及功能、pass waypass waypass waypass way、蛋白质图谱等蛋白质图谱等蛋白质图谱等蛋白质图谱等）基因词典基因词典Rea
49、l Time PCRReal Time PCR引物及探针设计引物及探针设计LOCUS NM_008777 1959 bp mRNA linear ROD 15-APR-2005DEFINITION Mus musculus phenylalanine hydroxylase(Pah),mRNA.ACCESSION NM_008777VERSION NM_008777.1 GI:6679202SOURCE Mus musculus(house mouse)ORGANISM Mus musculusFEATURES Location/Qualifiersgene 1.1959 /gene=Pah
50、/db_xref=GeneID:18478 /db_xref=MGI:97473 CDS 48.1409 /gene=Pah /note=go_function:iron ion binding goid 0005506 /protein_id=NP_032803.1 /db_xref=GI:6679203 /db_xref=GeneID:18478 /db_xref=MGI:97473ORIGIN 1 aattcaaccc tgtgctaagc tagacacctc acttactgag agccagcatg gcagctgttg 61 tcctggagaa cggagtcctg agcag
