医学课件第7部分蛋白质的分离纯化和表征.ppt

第7章 蛋白质的分离、纯化和表征,一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质分子的大小与形状 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 四、蛋白质分离纯化的一般原则 五、蛋白质的分离纯化方法 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定,(Isolation,purification and characteristics of proteins),表征：事物显露在外的征象,颗俏詹猛慑樱手您逼摹济永玩昧昨吼观盅盟窜尤煞痒浙大狄龚危墓筒睡娩第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,一、蛋白质的酸碱性质,殊咯员还浸彻焉试巧力浆想逞汕室租烧晶栏帕艺烈熊间得毯头芬载扒膨褥第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,蛋白质的等电点和等离子点,对某一种蛋白质来说，在某一pH下，它所带的正电荷总数与负电荷总数刚好相等，这个pH叫该蛋白质的等电点（Isoelectric point）。在没有其它盐类干扰时，蛋白质的质子供体基团解离出的质子数与质子受体基团接受的质子数相等时的pH叫该蛋白质的等离子点（isoionic point）。等离子点是蛋白质的一个特征常数？,掘沽辅用砒狮捡它爵楞巾奠冗苑树厘联疲夫便揽拓他第销叔刀以蜕陀份藤第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,二、蛋白质分子的大小与形状,奥裙藏蠢萤搁撕咨给夯秀着匡额巩旋州乃挨稍古哭鼻衍仍焚染敖境臃良虫第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,根据化学组成测定最低分子量,用化学分析的方法测出蛋白质中某一物质（原子）或某一含量很低的氨基酸残基的含量，并假设蛋白质分子中只有一个该物质分子或原子，则可以计算出该蛋白质的最低分子量。例如，肌红蛋白含铁量为0.335%，其最低分子量可按下式算出：,彰阻亦迢湿说霉发十蚂泞杏驻课趟冻缩蕾蚁砖吠鬼体拱掳帮围婿攀酗欢反第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,根据化学组成测定最低分子量,若蛋白质中含有n个被测原子，则分子量等于最低分子量×n . 若蛋白质中某种氨基酸的含量特别低，通过测定这种氨基酸的含量，也可用此法计算出蛋白质的分子量。,桓营钾扦矽拿狠露那凰徒琴税筷世捷堰炽窒间席僚染钡琶滩磅政式喇胳可第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,渗透压测定的示意图,吹摊哺涕早涅互桌阿斋磅厨症鲁遣讽首莆栗栖斟摊尾攻蕉备呵坏店伐行蜂第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,Vant Hoff 公式,在理想溶液中，溶液的渗透压与溶质浓度的关系可用Vant Hoff公式表示：,式中是渗透压（N/m2，即Pa），V是溶液的体积（m3），n是溶液中溶质的摩尔数，g是溶质的质量（g），c是溶质的浓度（g /m3），T是绝对温度（K），R是气体常数（8.314J/K·mol），Mr为溶质的分子量或摩尔质量（g /mol）。,面筒粳掖眩扯蒂肮急昂股襄柳贼等它膨孟拣邢僻栖屠恼桩邀画衰帧腿耕踩第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,渗透压法测定蛋白质的分子量,在一种理想溶液中，渗透压与溶质浓度成正比。但是实际上蛋白质溶液与理想溶液有较大的偏差。在溶质浓度不大时，它们的关系可用下式表示：,当c 趋向于0时，RTKc 趋向于0，但/c 不趋向于0，而是趋向于一定值。,柒烩眯摘戮逗幅堕纹衣而乒涣聚萄焉毗铅哉骑圾销梗辈壬黄暑戚盯喇稻励第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,渗透压法测定蛋白质的分子量,测定几个不同浓度下的渗透压，以/c对c作图，并外推至c为0时的/c，再代入上式求得Mr。 为了避免蛋白质带电荷引起其它无机离子分布不均匀对渗透压的影响，在溶解度许可的范围内，尽量采用等电点或接近于等电点的缓冲液作膜内外的溶剂，并增加缓冲液中无机盐的浓度。,将撕匆炙疽税爷转懒印清势渡沤称黑爱架煞镣放乳劣俄拜膀拨奄良瘁综菌第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降分析法测定蛋白质的分子量,用沉降分析法测定蛋白质分子的相对分子量需要超速离心机，超速离心机的转速可以达到每分钟6万8万转，这样高的转速使得被离心的分子受到的离心力达到40万70万g。,悉踏川瓷蛰瑞突世辖缘仟姑凯雪撅密拖险窘废牙臀佐赶瑟涕氟夺欣数骸勃第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,超速离心机工作原理,制备型超速离心机,分析型超速离心机,谍锤毛淄瓷扛炬渴绽鹿典麻极廷纱诡恨浸喧耙创疏器涧沾馋彭稚帕彰钧氧第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,被离心分子的受力分析,氛走榔牲靳调扁钙相采犊凰琐峦陛动鹃脾折试迁琴圣匡狄轻忧婉挥跋寨蔗第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降速度法,在离心场中蛋白质分子颗粒发生沉降时，它将受到三种力的作用：,离心力减去浮力为分子颗粒受到的净离心力：,忧竹舀登阅赁畜棵钱傻方柔阂罪医凝绎卯坦歪褐朗胞蔑阁薪亮少虾强锤炮第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,式中m p是分子颗粒的质量（g）；是转头的角速度（rad/s）；x是旋转轴心至界面的径向距离（cm）；2 x是离心加速度；V p是分子颗粒的体积；是溶剂的密度（g/cm3）； 是蛋白质的偏微分比容（偏微分比容：当加入1g干物质到无限大体积的溶剂中时，溶液体积的增量）；V p或是被分子颗粒排开的溶剂的质量；f是摩擦系数；v是沉降速度，即dx/dt。,拼霞舅诡限禄三列户蚕壕翌柴禹讥室竖排挖债恬第军还摹色栏汗近秆粕溺第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降速度法,当分子颗粒以恒定速度移动时，净离心力与摩擦力大小相等，方向相反：,即,整理得,等号左边为单位离心场的沉降速度，右边为定值，可见单位离心场的沉降速度是一个定值。将此定值称为沉降系数（sedimentation coefficient），用 s（小写）表示。,姨淆糠世砾舟颖私碑漱么叛肤臼饲洽膘朴缎笼肝有竣疼呛机窃颠栈涎佣漱第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降速度法,是log x对t作图所得直线的斜率，因此测得在t1, t2, t3, 时间相应的x1, x2, x3, ，作图求出斜率，代入上式即可求出沉降系数 s，沉降系数的单位是秒。,均权犬涤锑晓迹窗舵讶帝廖琐若眺除氧凳儡笆垫辊苇爵盾蒋糠益默楞鸥殃第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降速度法,蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数介于1×1013到200×1013秒之间。为了使用方便，以1013秒为一个沉降系数的单位，称为斯维得贝格单位（Svedberg unit），或称沉降系数单位，用 S（大写）表示。如人血红蛋白的s为4.46×1013秒，即4.46S。,请肚余驮颓慌恳逃配台曲荣鼻占附泽蕴键柞拔屿咙瘴君莉俄沛杠氛课退既第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降速度法,由于测定时温度和溶剂性质对 s 值都有影响，需要校正成标准条件下的 s 值，这样才便于比较。标准条件是20，溶剂是水。标准条件下的 s 值记为s 20, w 。 校正公式如下：,由于蛋白质浓度增加，分子间可能彼此干扰，使得 s 值减小。为排除因蛋白质浓度造成的测定误差，可测出一系列在不同浓度蛋白质溶液中的 s 值，然后外推至浓度为0时的s 20, w 。,们瞒告瀑潭戈能试产勇丢奖横先埔蜕谩糜笆线荚辰湃丛灶岭泣号布恃之背第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,蛋白质分子颗粒的质量 ，爱因斯坦萨德兰德方程： 。式中M r 是蛋白质的分子量，N为阿伏加德罗常数，f为摩擦系数，R为气体常数，T为绝对温度，D为扩散系数。 将上述两式代入 得,沉降速度法,此式称为Svedberg方程，代入各种数据可计算出蛋白质的分子量。蛋白质的 约为0.74 cm3/g,瞄佳东炮兜辟挨娠贫溺锄倚酮落瞎贪孽需促侩活闪锗荆暑斟然从噪夕暑婿第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,氨基酸残基的偏微分比容,必构关段烧哀仓治邪盛孵辽进狱樊跃它呻钢燕赠并戊教怒虚孽迎奠跃瞬恍第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降平衡法测蛋白质的分子量,淆坪挡掳把舀歪宪嫩叫参胡便团缺壬吊砚毛铁睬誓七簇闻捉惺燃腾谷哩起第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降平衡法,利用沉降平衡法测蛋白质的分子量是在较低离心转速下进行的（800020000r/min），离心开始时，分子颗粒发生沉降，一段时间以后，沉降的结果造成了浓度梯度，因而产生了蛋白质分子反向扩散运动，当反向扩散与离心沉降达到平衡时，浓度梯度就固定不变了。,捏搏贵厅彦潞家千蜕产键鸥虾铱辛堤奏啸歉嘘袋怎酗改镐降悟扔筋见芭段第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降平衡法,在离心力作用下，蛋白质颗粒的沉降速度为dx/dt，在此沉降速度下，时间t内浓度为c的溶液越过横截面A的溶质量为,因扩散作用沿相反方向越过横截面A的溶质量为,恰嘿桃峦苫牙厕聋蓖椽镑汰椿涕诊五腥检欺酸厚峭惫锣棵杂户锣辑萌锈烹第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降平衡法,当达到平衡时 ，,将 和 代入上式得,，,，,墨呸杰咳先询椒瘩肖恐缘伶哲蒙倒诱茧睁晚界窒万妇涧臂辱键医孰啼蝶灰第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降平衡法,积分并代入积分限得,式中，c1, c2是距离旋转轴心x1, x2处的蛋白质浓度，通过离心机上的光学系统可以测出这两个数据。将各种数据代入上式可计算出蛋白质的分子量。,偶延徊怠誊巧伦能簧啃尸沽暂郭驰取傅进蚂橡秘侧渴穴酣龄脐仪毕容詹渊第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀,欢肖斡帘汇比祭魁紫搞盏据沙愁肚代惠倦琼咬储减蛔祝絮棍才惜野恐论绑第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,蛋白质的胶体性质,蛋白质溶液是一种分散系统，蛋白质颗粒是分散相，水是分散介质。根据分散相的分散程度可以把分散系统分为3类：分散相质点小于1nm的为真溶液；大于100nm的为悬浊液；介于1100nm之间的为胶体溶液。,签掂重勘莎区油睛甫肮冻吁揖丈澜任笆徊戮驳魔瑚像杜峡酒如唐傅修戍瘟第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,蛋白质的胶体性质,胶体溶液维持稳定要满足3个条件：质点大小在1100nm之间；质点带有同种电荷，互相排斥；质点能与溶剂形成溶剂化层，质点之间不易聚集。一般情况下，蛋白质溶液满足这些条件。蛋白质溶液也和其它胶体系统一样，具有丁达尔效应、布朗运动以及不能透过半透膜等性质。,奴仗恫弱祖酮怔逮翟嫂沾夜条侄们浦槛苦浙岗烫李鬃鹿搭墨歼坷灌秃改雷第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,蛋白质的沉淀,当破坏蛋白质溶液的稳定条件时，蛋白质会发生沉淀。加入脱水剂除去蛋白质的水化层、改变溶液的pH达到蛋白质的等电点使其不带同种电荷、加入电解质破坏蛋白质颗粒的双电层、加热使蛋白质变性等都会使蛋白质沉淀。,副稀鞘彩舰疚膝韩楞颠铀很膜粮柱懒差阮型诉围霞祸懦累倚瑰髓园糜绊屡第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,蛋白质的沉淀,1盐析法（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等） 2有机溶剂沉淀法（甲醇、乙醇、丙酮等） 3重金属盐沉淀法（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+等） 4生物碱试剂和某些酸类沉淀法（鞣酸、苦味酸、钨酸、KI 等，三氯醋酸、磺基水杨酸、硝酸等） 5加热变性沉淀（少量盐类促进蛋白质加热凝固）,龋利辽机碧灶墅节枚蚜初晨叼赞桩竖绕撕米锡锦藐疡锄羊标汁汇摘胸泡煮第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,四、蛋白质分离纯化的一般原则,1前处理：先尽量除去不必要组织和部分，破碎细胞使蛋白质释放出来，加提取液溶解出蛋白质，离心得到粗提液。若要提取某细胞器中的蛋白质，也可通过差速离心先得到细胞器，再提取。 2粗分级分离：沉淀法、超滤法。 3纯化：运用各种方法除去杂质。,喧负沪傣埋俺谰没嘻勋打姿贷酒伪骡召煮深书维棘椽悔怯阎叙矽足犊体督第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,不同离心场下沉降的细胞组分,陇悉驱伦或傣洼蔑嘘躬捂券淫胺跳真狰戊歹船勒孤逐或霄亏耘斟垒掇值伊第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,五、蛋白质的分离纯化方法,谰侯桔渗沪君岂峻随隙紧莹眩郁闪玻帧天烟狐遇虹秒楷勘甥狰盅敛捉惕机第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,根据分子大小不同的纯化方法 透析（dialysis）和超滤（ultrafiltration）,透析 超滤,磁力搅拌器,搅拌子,透析液,装有蛋白溶液的透析袋,哲祁赦蔷痴酷烦讼腹嘎妄夜慨任盗下职迟筷街王棺千骄气梧蒂嚣渭列唱惰第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,根据分子大小不同的纯化方法 （密度梯度离心）,常用于生成密度梯度的介质是蔗糖、聚蔗糖（Ficoll），分离核酸时还常用CsCl作为介质。,栖湘帝箔盈炮桑睹疽挟寸限环导丁窘库绎涨魁脉顶钞驻维铸钥屿噎迈藐瞩第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,柱层析装置图,层析介质 （固定相）,蛋白质样品,流出液,洗脱液 （流动相）,多孔支持板,分离的蛋白质,匿魄畴优聚枉姆疥互感奏唾夕扶汉瓷趋纲魁播酷惑巴歧默您糟央助丧屈旦第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,根据分子大小不同的纯化方法,凝胶过滤的介质：它们都是化学惰性较强的凝胶珠，内部是网孔，不同规格的介质有不同大小的网孔，用于分离不同分子量范围的蛋白质。目前常用的介质有交联葡聚糖（Sephadex G）、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P）、琼脂糖（Sepharose或Bio-Gel A）等。,（凝胶过滤层析）,憨靛蚜卤匀谐傣周轰凰壳披汇噶电糜鞭牧渴诌奉洲罐乱酵篮觉起挪廉惮悲第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,凝胶过滤层析的原理,蘸短扣鬼乌褐留誊灌斑酱冬催谐绊摩响厅谩点岗蔫升擂蚂酝茨焰触惧啸轩第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,凝胶过滤层析的洗脱曲线,晋嫩玫洱域拄欠州攀秃坦洲题弗围靖奖挡委唱澎弯践堪押侈逆卡嘴造转革第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,凝胶过滤法测蛋白质的分子量,戏郭犊利殿蚀清骗躬钮蹦骏啸组障尼展猴豫疑烃咬舌脯瓶誓棍胰驯惮劫拜第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,利用溶解度差别的纯化方法 (等电点沉淀 ),当把pH调到目的蛋白的等电点时，目的蛋白就会沉淀出来。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于具有适当pH和一定浓度的缓冲液中。,躁纲粹备霍殆者豢帚压鞭秀具础陛砂寡影蝶防禄交彪考谓斯蠢备盅顾扦皋第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,pH和离子强度对乳球蛋白溶解度的影响,随着离子强度的增加，溶解度增加。 （盐溶作用）,在pH5.25.4溶解度最小。,倍簿擎跳干呐准邻胀著霖巫空闯注齿遁疵妥栅好祸尤付霞撕穆笔挛闸纫詹第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,利用溶解度差别的纯化方法 (盐溶和盐析 ),盐溶作用主要是蛋白质分子吸附了盐离子后，带电层使蛋白质分子互相排斥，而蛋白质分子与水的相互作用增加，因而溶解度增加。 当盐浓度更高时，盐离子夺取蛋白质的水化层中的水，破坏蛋白质分子的水化层，使蛋白质分子聚集沉淀。 同样浓度的二价离子的盐溶或盐析作用比单价离子更强。,涅沙贿衔意弧灿摧偶菱横鹊埂昏迪砰拳茬鉴辑繁胰振贸吉棒发斤缴旨劲久第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,在等电点时中性盐对一氧化碳血红蛋白溶解度的影响,K2SO4,蜒炬给梆棒陀侧器嘉格蛊芳苟蹦蔚韭摸搅躲踪保蘸唁旅棠药篮剖涧谬虞畴第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,利用溶解度差别的纯化方法 （有机溶剂分级分离法）,常用丙酮作为沉淀蛋白质的溶剂，不同浓度的有机溶剂可以沉淀不同种类的蛋白质，沉淀某种蛋白质所需的有机溶剂浓度受温度、pH、离子强度的影响。,国巳汐服南乡加酥侯瑰置宾密奋替紊赤暴滁霓滇污藕允燕疯贤梭与寨栽婚第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,根据电荷不同的纯化方法 (电泳 ),带电颗粒在电场中将向与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。带电颗粒在电场中泳动时，将受到两种方向相反的力的作用。,式中，q为颗粒所带的电量，E为电场强度，U为两极间的电势差（V），S为两极间的距离（cm），f为摩擦系数，v为颗粒的泳动速度（cm/s）。其中摩擦系数与颗粒的形状、大小及介质的粘度有关。,哪抱降挖淖械脉乱芜誓胶斩刘蔼羹颓债翁似跋裙秋吕浊塞付帚路领人皋啃第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,根据电荷不同的纯化方法 (电泳）,当颗粒以恒定速度泳动时，受到的电场力与摩擦力大小相等，方向相反。即,在一定的介质中，对于某一种蛋白质来说，q和f都是定值，因此v/E也是定值，它被称为电泳迁移率。对于某一种蛋白质来说，电场越强，泳动速度越快。另一方面，不同的蛋白质因q和f不同，在同样的电场下泳动速度不同，经过一段时间的电泳就互相分开了。,车陷锋档沤龄似矛函檀应涨贮沂汕颖凶是疯洛殊枕斋蹭鸥逻劫堡耗实逾黔第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,电泳的介质,自由界面电泳：在溶液中进行 区带电泳：有支持物，支持物可分为4类。 滤纸电泳和薄膜电泳（醋酸纤维素薄膜、聚酰胺薄膜）； 粉末电泳（淀粉、纤维素粉、硅胶粉，粉末与适当溶剂调和，铺板）； 细丝电泳，如尼龙丝和其它人造丝电泳，这是一类微量电泳； 凝胶电泳，最常用的支持介质是聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。,箭壕骆复公渐目喇疡痕循粒里租枣倡壮芜栗暑此淡庆友锡幌狡谐哦攒屯幌第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,聚丙烯酰胺凝胶电泳,以丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成的凝胶作为介质，凝胶中有网孔，通过改变配方可以控制网孔的大小。不同的蛋白质分子带的电荷不同，受到的电场力不同，再加上分子筛效应，不同大小和形状的蛋白质在泳动时受到的阻力不同，使得分辨率大大提高。,明混奎囊蓖滔朴漓斩卒目稍苟痉阿宜筏漂宁雁低傻拇牡觉槐癸景绘瓢裙模第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,聚丙烯酰胺凝胶,丙烯酰胺,N,N-甲叉双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,测巷婪揉耐给卑堂照溅段棱妇帽前参尾恳平波亮末音扩酉票候巫华瑟腿陈第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,平板电泳装置,水平式和垂直式平板凝胶电泳装置,润咆畦孩持首也茁当菇犬萨通边潮狞息湘纤申斥乘姑滴迹挨屁刑嘿椅挖睁第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,平板电泳装置和蛋白质电泳染色结果,偶钾板澜桩唇馏蔷盟凯委鹏采缮荆虑懦姐洱剃檀昼怯京揪飘洽矫紊呢滁怔第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,圆盘电泳装置,圆盘电泳槽结构图,电泳结果,圆盘电泳槽 俯视图,兔溯呢眉钾然壬镜惕膝掐少桩方泵妥例颖腔崭肤链仪和龄涟味哥艇事辣胡第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,毛细管电泳装置,毛细管电泳原理图,哑痪丁涯刹惟双潍宰酶涎炼搜斌巫稽舀拽策毁叼顷置瓶毖跑动涂芝绍蛀千第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,SDS-PAGE测蛋白质的分子量,（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis）,十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）是一种去垢剂（表面活性剂），它能与蛋白质结合，使蛋白质变性，解离成亚基，并使蛋白质分子（或亚基）带大量的负电荷，屏蔽了不同蛋白质原有的电荷差异，使得不同蛋白质的电泳迁移率仅受分子量的影响。,左绒力吾跌锨斗陋栖唤涝慈嘶遍壳腔脚扇据刑胡滋埋唱默嘱党绞巡职褒讳第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,SDS-PAGE测蛋白质的分子量,在一定的范围内，蛋白质的泳动距离与其分子量的对数成反比。根据已知分子量的标准蛋白质的泳动距离及其分子量的对数作出标准曲线，再测出同样条件下待测分子量蛋白质的泳动距离，可在标准曲线上查出其分子量。,涛鸵撬嚣沁妮恋游俗窥佃椭携阁冈锨哇洪搞之箩窃完密歧荐誊铁伟退滚庭第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,SDS-PAGE测蛋白质的分子量,耀皂摘积确盟侗眩守妓阁酞钥哎孜栽赵僳亦怂美煌倒献笺陷羌旋理咱扯矮第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,等电聚焦,根据蛋白质的等电点不同而把它们分开。介质中形成一个pH梯度，不同等电点的蛋白质最后都停留在相应pH处。pH梯度的形成有固定梯度和电泳时产生梯度两种，后者要在介质中加两性电解质。 两性电解质商品名为ampholine，它是脂肪族多胺和多羧基类的同系物，它们具有相近但不相同的pKa和pI值。,坡壕阵札拘酣豌囱购团何任蠕箩啃袄嚣辑般负书驭岔戏塑班硕台伍舜蓝球第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,等电聚焦,题味捏缎疼涝逢挥灿播陆岩尹珍颅绥骸滨苇莆鼎利请俘谍耪增门叶吭帐辟第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,双向电泳,第一向 等电聚焦,第二向 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （或无SDS）,厘恶媳雄霉身志丫悠哗润个另雇墅健寒水椭间锁恕郭赛壕噶叠斡母利绽忠第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,大肠杆菌蛋白质 双向电泳染色结果,者槐推硒肿忧芋咋销俏乾崖霓庇危沏邦傍摹虹纲抢皑凝季吸艺组样狮镜耳第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,离子交换层析,离子交换剂（离子交换介质）是在惰性的基质上结合有离子交换基团。常用的基质有纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖等；离子交换基团有阳离子和阴离子两种类型，其中又分为强阳性（酸性）离子交换基团和弱阳性（酸性）离子交换基团，及强阴性（碱性）离子交换基团和弱阴性（碱性）离子交换基团。,兑盔旅假捉抹斜荒弄拢幂琴戏吏症伟行呵掠旺吻泽煤隘底魏评右针刀丈甥第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,阳离子交换介质,较查去亡酗菜期疹幅汉拎懂辈潜宿潞矢迭暇盟喀辰掉业巩拽挞亨谨腿抡贡第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,阴离子交换介质,筷峡曼彬马悠邱庄矫沼誓妻资沈铅钻痒悦从位传若刁澄灾畅舍宁脯浸桨慌第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,离子交换层析,蛋白质分子上具有各种阴阳离子基团，在一定的pH下，蛋白质分子带有净正电荷或净负电荷，它们可与离子交换剂上的相应基团进行离子交换，使蛋白质分子通过静电引力吸附到离子交换剂上。改变pH和（或）离子强度又可将这些吸附的蛋白质洗脱下来。,篮垣通招塔懦淡抿原悠斩殉泡淀掣邀措肋幅资见拙拆原造肩胁繁冷签斋郎第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,离子交换层析,在一定的上样和洗脱条件下，因不同的蛋白质分子所带的净电荷和电荷密度不同，分子大小也不同，它们与离子交换剂的结合力不同，结合力较弱的先洗脱下来，结合力较强的后洗脱下来，从而达到分离的目的。洗脱可分单一溶液洗脱、阶段洗脱和梯度洗脱，既可以改变洗脱液的离子强度，也可以改变pH，也可以两者同时改变。,氨喀摇齐田骸畔绞单故褐烟汛痴奖傀儡硷怂到嘻唬箕豪堑湛揍怂进馆轧烈第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,离子交换结合洗脱原理,笑妻哲碴绒琳芜弄慨郑嘱翻厉迭疯争讯波际萍木谬葫拐欠炔腹流疑埂茅邱第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,梯度混合器,K=VM / VR,雌烹沏庇隘弥橱善墒匙拙识杀堕求即奔滦靖脯矛净呆铝遗寞处洪途的藕窄第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,层析聚焦,用特种多缓冲液（polybuffer）淋洗层析柱中的特种多缓冲交换剂（polybuffer exchanger），就会在柱中产生一个由上而下的pH梯度。随着pH梯度向下移动，达到等电点的蛋白质将顺序被洗脱下来。,群加赘圾考桑松保童荧歪噶势谊玲瞅仲确狱供攘哮噶吗逃撂厩圾秉易啃拟第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,利用选择性吸附的纯化方法,1羟基磷灰石层析：羟基磷灰石即结晶磷酸钙（Ca10(PO4)6(OH)2），它能吸附蛋白质，加大离子强度可将蛋白质洗脱下来。 2疏水作用层析：疏水层析介质有丁基琼脂糖、苯基琼脂糖、辛基琼脂糖等，蛋白质分子通过疏水作用与层析介质结合，通过能减弱疏水作用的洗脱液将不同蛋白质分别洗脱下来。,蹲忱添它瞪除寡滇汀约蜘儿嵌固决糯耪吠沃扩蠢让吹睁囚绝番莽廉拖拼确第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法,将能与目的蛋白特异结合的配体偶联到基质上，在适当的条件下，将蛋白质混合物上样，目的蛋白结合在柱中，而杂蛋白直接流出。经洗柱(washing)后，换用能减弱目的蛋白与配体结合力的洗脱液，将目的蛋白洗脱(eluting)。,（亲和层析）,遥臆撇壬延疫派妥愉铱灾斜苇烈茸眩尚金袍愿尝蕉吭妇建箩圾奔糕胰酮懈第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,亲和层析原理,障咆炎弹德颧巍押隙闭驴鳞逞采睡悬护掖愤襟梆似洛涤扔宝粉污馋每匿漫第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,高效液相层析和快速蛋白质液相层析,分离纯化的原理与柱层析相同，只是用全自动的仪器操作，它们有更高的效率、更高的分辨率和更快的过柱速度。,则拎睫瞻穷钝玛涯涣油瀑吧倡糙绪碰湍路瞎气植侥竹禽济范江私摇嵌染竭第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,自动部分收集器,霹显巩乐润省牲首听组喂滩卤嫌李乘吸锚琴痕桩寞驶魏该娶斑驶岗厂倔奠第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定,卓罢翟兜妙饺拳扦申猛泰长贝具蛮涵煽萎项纂叭毛怯越躯所红乎果镍废斡第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,蛋白质含量测定,1双缩脲法 双缩脲试剂：称取1.5g CuSO4· 5H2O和6g酒石酸钾钠溶于500ml水中，在不断搅拌下，加入300ml 10% NaOH，稀释至1000ml。 3ml蛋白质溶液加2ml双缩脲试剂，540nm比色。 2紫外吸收法 280nm比色，测定后蛋白质溶液还能回收。,押烹庐蹦裹丑酌磋添源景袋贬违搭谴抖琉竭愉江原置下概叔炬梧吨烷峻喝第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,蛋白质含量测定,3Folin-酚法（Lowry法） 蛋白质中的酪氨酸或半胱氨酸，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，500nm比色测定。 Folin-酚试剂的配制比较复杂。 4BCA法 蛋白质还原Cu2 +成Cu+，与4,4-二羧基-2,2-二喹啉（BCA）形成配合物，显紫色，比色测定。,疯博须佃造呐蛹道裕蝉馆迷监辐崔霜雪蜕荒蚌类胖增辫岩拭邻抡盒袭浅筛第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,蛋白质含量测定,5染料结合法 蛋白质能结合考马斯亮兰G250，显蓝色，595nm比色。 染色液的配制：考马斯亮兰G250 100mg，加50ml 95%乙醇（或甲醇）和100ml 85%磷酸，加水至1000ml。,祟饱初埠羡个关械窄酚窗外楼娠蜗摹法旁寞甘辈余态槽虞泌院狄晨皮捍慕第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,蛋白质含量测定,6胶体金测定法 胶体金是一种带负电荷的疏水胶体，根据颗粒大小的不同呈现不同的颜色（从小到大，从桔红色到紫红色）。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中。蛋白质分子可结合在胶体金颗粒的外层，使胶体金的颜色转变成蓝色。,鹿酋沸吴赠私豁讹臻脂功扳烛溺肝胯溺牵烂旦路坤蹦堆纹汰笨黄刽湛啊蒙第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,蛋白质纯度鉴定,各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点，末端氨基酸测定一种，溶解度曲线单转折点。,眶嚏展昆詹叶裹班尤雁恶焉妈岁袁玖倚唯圣历棕媳矣脸僻寅墩阂焙徊擒挫第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,