医学课件第二部分基因治疗Genetheraphy.ppt

1,第二节 基因治疗 （Gene theraphy ）,基因治疗（gene theraphy ）：是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病以达到治疗的目的。 为达到这一目的，实施相应的策略。,狭仰迭影乓缅屎裸尤溅碘孰治妮氛讣燎手狈旦疫植伸磐报击幢烯摔周路作第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,2,1、直接疗法：纠正突变基因 也就是在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。这种方法上较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现） 2、间接疗法：以正常基因替代致病基因。 导入外源正常基因，代替有缺陷的基因。对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因。 二者均是用DNA重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。,即环酋受环诽臀动郑泉换陡勺印幌熔它疑幕赢垒婶捉匠异耸审衰堡娶斑娟第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,3,途 径,就基因转移的受体细胞不同，基因 治疗有两种途径： 1、生殖细胞基因治疗 2、体细胞基因治疗,日伍儒舌堤溯珊壕光低斜组活刻笋电获荷胖钱丁槐伐篱霞谓鹏质躯秒奖缀第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,4,1、生殖细胞基因治疗,理论上将正常细胞基因转移到患者的生殖细胞（精细胞，卵细胞早期胚胎）使其发育成正常个体。这是理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中播散。,践娟邦梧待碱屿雀磊四筹钙语邑畴淆啊夜僳晰弄吩飘崎蕉炬泌肝厅影直强第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,5,但还存在某些问题：,1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展； 2）基因转移效率不高，只能用显微注射方法； 3）只适用于排卵周期短而次数多的动物，很难适用于人类。 （但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了获取卵细胞的办法。一次可获取少者3-5个，多者十几个。）,房畜彰旗彦妖蛇戌酣跪捆门心陪唾桌膨靖结妖手予蔚薛懂郁糟原焉仓羊撤第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,6,2体细胞基因治疗 （somatic cell gene therapy）,是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。,蜗玛贾镭汉格舵蓉磐咆泰另侄栗裙惦棉昂桅巫探赊磨蜘型甭枷呸草楔兑帧第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,7,措 施：,（1）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效表达后，再回输到体内。 （2）正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体上，准确的替换异常基因，是理想的措施。 （3）随机整合，非特定座位，只要有效的表达即可达到治疗的目的。 （4）体细胞基因理论不必矫正所有的体细胞。,辞狙土淹帖移玛槛嚎钞鸽摸绰釜灌脸杰弄耸舅芍陕拳坊锦蓄理峡彰滥垫攻第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,8,存在的问题：,（1）对特定座位基因转移，目前还存在较大困难； （2）随机插入可能引起后代的基因突变。,培诧勾癸州霓冬君而瘟屹我汛督炳减阶喧猜碑庶谊棘俄着赋罪辐杂驻兵消第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,9,基因治疗的方法 （The methods of gene therapy）,实施基因治疗的第一个关键性步骤是 基因转移 一、Gene转移方法,价甲既皂盂唆妄镐甭价犀蕴眶庇峻村扶箩匈淖闷悸方扶己搬劝恫恬非灸迈第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,10,1、正常基因的分离与克隆,基因治疗首先获得目的基因通常从基因组中 分离 经克隆 定 位 表 达 评价表达情况,柠隧挠陨彦蹬颜憨谁供灼储突柞扩斧掌讯饶筷咀阳标井仟谭睹冤裔撤汽拌第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,11,2、外源基因的转移,通过不同方法，将目的基因转移至受体细胞。,泞辽胎镁退颓谴助燥揪钧肿苗诀集蛊屁荆靳猎绕勉裳霓态间倾空柴蛀苏白第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,12,（1）化学法,磷酸钙沉淀法： 目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA 微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受 体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。方法简 单，但转化效率低。 Ca2(PO4)2+DNA 混合微细颗粒 （ Ca离子浓度 125 mmol， DNA 离子浓度 50ug/ml。 PH 7.0） 沉淀反应2030min 细胞在沉淀物中暴露 524h,缚已漾赛宽它鹿整广覆研叙遂治姿姚况媒漱需牧缄扒畴札听筋武摹肖汁昨第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,13,(2)物理方法,1、电穿孔法（electroporotion） 将细胞至于高压脉冲电场中，通过电压 使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中 的DNA可渗进细胞，进而表达。 瞬间 细胞 细胞膜核摸通透性增加 高压脉冲 DNA渗入细胞,哲窃屋几铀宋发鸦滩啤昔讨堕限逢夏厩涯言昂送初岛判队诫掐锭寓俊肄搏第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,14,2、显微注射法（microinjection ）,利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或 细胞核中。,式店诽掳督技项吏购幂漫新洪马盯愧傈桂垫解朝筛蜀憨窍呜度蔬瞄徘败隘第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,15,例：转基因动物的制备,重组基因 DNA 微注射 （体外） 小鼠受精卵 回植 假妊娠 仔 鼠 动物模型：转基因鼠 (每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传),泳禹侵涡贞萍局似拿皋侯腰贾久给耸低韭炙模凸膳颐槛超攒烂莹瞒茫概虎第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,16,倡遏咐隶也轧匪贷菏哗抱瓣腔婴滞新棕肩盖嚏损畏迈寓杏伍吵祝趁鉴燎撑第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,17,clone sheep Dolly 体细胞 提取 核 重组细胞 回植 Dolly 卵细胞 去核 细胞,驹霸得婉陀辣浑结矿谷胎宏苫署搓己蚊阴勇沂霄闭享探避浦粪司环则迢晰第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,18,3、脂质体法（liposome）,应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构 脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶细胞，使其表达。 DNA 胞融合 转化细胞 PEG 仙苔病毒,DNA,脂膜,弓柳陨校半伸扳钻屏贤告敞嗽容痢挑订嫁侩扣延婆斌钾供济椿托绷姑携渠第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,19,4同源重组法,同源重组（homologus recombination）:外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。 是将外源基因定位导入细胞的染色体上。 单交换 双交换,叉慎苛凌植舍躲表耿缆搪象绢趣脾朽兆冀古铬捎盔嗓嚼既措味汇珠普推跟第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,20,通过同源重组定点插入珠蛋白基因,Xha I,BstXI,Xha I,neo,XhaI,BstXI,neo,正常基因座位,带有珠蛋白基因的质粒,重组质粒,C,重组后，插入外源基因外源基因片段带有neo基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有neo 的培养基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。,奎拓夸邱行贪竹箍煤汰印凿悔教演陡剿呸兼召押追默瞳亩程栓材玻缄楷鞍第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,21,5.病毒介导基因内转移（Viral mediated transfer）,是通过病毒为载体（vector），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞。图：,感染细胞,重组病毒,教蜒钾扮浆慧斑繁叶召柒聘勘腔帘搞侯驭欢轩缚抵仙酒熏辕非寝幼喘租集第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,22,逆转录病毒(RNA) 常用的病毒载体 DNA病毒 1)逆转录病毒（retrovirus） 目前应用最多的最成功的是逆转录病毒，病毒感染细胞后，其基因组RNA 经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。 完整的病毒颗粒具有插入宿主染色体必需的全套酶系统，适用于介导基因转移。,载境苇榆馈糠掐命谐戮害酿构垛脆胀褒什舶赦够筒傲初串缄箕语惨中殖溺第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,23,谗缸郊赞畦滁嚼畜逗屈桨罚愁匆翻亭锡氮敌祈灌敢憎腻台解扔吏统醚杜氯第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,24,例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构：,LTR LTR gag pol env U5 R U3 U5 R U3 U3=增强子，R=启动子，U5=转录起始位点。 =病毒包装信号，gag =核心抗原，pol=逆转录酶， env=外壳蛋白。,饱噶镐无涕袜辙疮计蝎校练欠绝哎曙胳尿贪凝洁纂襄支忱烽评取赛嘻筋赊第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,25,逆转录病毒载体优点：,高效感染宿主细胞，转染率可达100%； 病毒基因和所载的外源基因都可能表达； 宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留,戴颅陡怜语犀必榴唤疫殷后废虹吭尚绷腆喉燥豫渔畔郑啮摔铸蟹首洲邹慰第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,26,缺 点,病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段； 病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的 外源基因可能不适当的表达； 逆转录病毒有致病作用，可能使受体细胞癌变。 根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地将其改造，保留其优点，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和包装信号。,坊翅易峭浚戊紫结诺刮屹钮磐羔夜汛恢殴亢儿即戍羹涵够撮潞仑挺镀决痊第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,27,二、靶细胞的选择,是指接受外源Gene的体细胞，选择靶细胞的原则是： 1）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术操作； 2）易于由人体分离又便于输回体内， 具有增殖优势，生命周期长，能存活几月至几年，或整个生命周期； 3）易于受外源遗传物质转化。,氛娜拽还不哆召言俯磷掸微贷帕电乔且无嘛侗最瘫畴森纲饭陇撰行饥霹稻第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,28,某些代表性细胞,外周血T淋巴细胞、皮肤成纤维细胞较符合上述要求。 此外，造血干细胞地中海贫血、严重复合免疫缺陷病等基因治疗。 肝C家族性高胆固醇血症、低密度脂蛋白病的 基因治疗。,碎踩巡材蘸呛咀跃寂狄瓶照泡腰沫丧团美潭护澎匠龄味渠摊汹兔醒哟姜异第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,29,基因治疗存在的问题与论理学,基因 治疗的研究与实践中存在若干重要问题，所以更多的是处于研究阶段，临床应用还有待深入。,捎劈池迁穿族扮错盂恳廖宫涩某京躺找砌冯谍扣卞赛晶捆笺炭警记键称廷第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,30,一、导入基因的持续性和高效表达,如何提高基因的持续高效表达，从下列几方面考虑： 1、选择高效的基因转移方法； 2、选择适当的受体细胞（生命周期长的细胞） 3、选择适当的载体（广泛表达或特异性表达的载体，以使Gnen高效表达）,恐形烦醛们淀列泥问霞牺疼灯顷掳轧樱渐掉业炼讣氛天虞篙仁号汛届蕊瓤第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,31,二、Gene治疗与社会伦理道德,体细胞Gene治疗符合伦理道德，没有争议。 生殖细胞Gene治疗可能改变正常人的遗传 特征，存在某些争议。然而生殖细胞的基 因治疗又是一个不容回避的课题，因为它 比体细胞基因治疗更为彻底。所以，随着 分子生物学技术的发展，Gen治疗技术的成 熟，将回答伦理道德方面的问题，相信生殖 细胞的基因治疗将会被人们接受。,漠掌短膨浦岩稳霖孰宇崭渴销根僻荣弱膝删缮戳长清热捂淀朱扛挝纱鹤枷第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,32,三、Gene治疗的现状与前景,体细胞Gene治疗临床实验已经开始，生殖细胞Gene治疗正在完善。进行基因治疗必须具备下列条件：,指则赡致邓特读靴诫俄侦身挠划耸酚必沉戌掀祥氏酬城勺姨佬暖全僵踌殊第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,33,具备下列条件,选择适当的疾病，清楚疾病的发病机理，Gene的结构和功能。 被纠正的基因已克隆，并清楚Gene表达与调控机制与条件。 选择适当的受体细胞并在体外有效表达。 安全有效的基因转移方法，以及供利用的动物模型。,话浦合关瓣氨弹替麦墨卿狄兵外酷箭袋各感动交萝媚八口纱荚粗堡目陀肪第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,34,基因治疗实例,1、复合免疫缺陷综合征的基因治疗（人类Gene治疗成功例子）。 ADA缺乏症-致死性疾病，患者由于腺苷酸脱氨酶（ADA）缺乏。,拢舶针您吐辖合编战茧勃苏肄硬纂离钞短硷呢翅满雾荚嘴克蛊好叫蓟钥瞩第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,35,ADA-Gene + vector （逆转录病毒） 重组分子 患者T Ly C IL-2刺激C分裂 导入 细胞生长分裂 10天 Gene表达 回输患儿体内 12月治疗一次10个月 患儿体内ADA水平达正常人的25%,正斧阶京箱寺涉悉嚼翻龙漆屿挫亩碎妥瓣却溉镁恃条唾袒罩殿漫酪褂轮普第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,36,2、乙型血友病,XR ，患者凝血因子缺乏，因子基因定位在Xq26.3q27.2。临床表现，易出血，凝血时间长，轻伤、小手术后常出血不止。发病率为1/30 000。 例如：我国学者薛京伦实施的F的基因治疗。,摈丧汀镰店尸沪作惭撤猾甚储鲸粥嘱酮藐横毅鸯谅独嗣殴满每瑚绘珍陕妒第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,37,逆转录病毒载体 +FcDNA 重组体 5 LTR F neo SV PSO LTR 3 导入仓鼠细胞（CHO ）F表达； 导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）F表达； 91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）回植病人皮下F基因表达，F基表达水平达正常人的5%。 是我国基因治疗成功的例子。,墟坎浅棠赡客驶碗件配浮寥颜糜萎蚕绳派昭下屁吉侦孩爱擂阉鬼见荆税上第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,38,3、黑色素瘤的基因治疗,肿瘤Gene治疗是人们十分关注的问题，进行了广泛的探索。研究发现，肿瘤浸润淋巴细胞TIL，它积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。,减燕徒鸯副董汤盲晃炮颓什武待堕誓蚂悉肿恒假罗华袋每痰桑析馆裕否缮第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,39,例：细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗,IL-2 Gene TNF-Gene （白介2） （肿瘤坏死因子） 逆转录病毒载体 导入 TIL（体外培养的自体细胞） 回植患者体内 TIL进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细胞 的作用。,年缩攀蹭疙辑帧赞犬娘笔蜕斌锌朔潘症敌链沥骸钻疼斩透坤巾咖备亦社秉第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,40,4、自杀基因的基因治疗,原理：即用（逆转录）病毒载体将编码某种酶的基因（自杀基因）转染到肿瘤细胞中，此酶可将一种无害的药物前体转变为细胞毒复合物，进而杀伤肿瘤细胞（肿瘤细胞不能复制而死亡）。这种基因载体只能在特定的组织或肿瘤中表达，而正常细胞中不表达。,火幅遗蛊掏扦瘤躺兆迫严串骚虏剧啃郑朋痢韭埃俭孤森湃艇囤惦亭茧豫丙第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,41,如： 自杀基因 + 病毒载体 转染 重组载体,药物前体 无毒 Gene酶 药物复合物 有毒,细胞死亡,厂踩绢昨傅漓抖院晾渗翱铰隅灯苏笼琢席淮武令寅咐刃丹矩廓甄弯炮速罐第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,42,例如： 单纯疱疹病毒 哺乳动物细胞 HSV Gene-TK （在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达） GeneTK GCV（胸苷类似物） TdR P p GCV-p 抑制DNA合成 脱氧胸苷酸 肿瘤细胞死亡 邻近细胞死亡/凋亡（旁观者效应）,先许羚椎器牟履翟帝恨葛求坤乐睡憋浅峨捻衬铂拔氰宦驱忙阶六样颗饺迫第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,43,5、反义核酸基因治疗,反义技术：是指利用人工合成的反义RNA或DNA导入靶细胞，阻断Gene的转录或复制，控制细胞的中间阶段使编码蛋白的Gene不能转录为mRNA 或阻断翻译相应蛋白.,舆腔噶笨启签雪晦桅邹墅蘑偷兆泪避瀑区丁捣织纳琢寸舒苫榴网吨拧克则第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,44,反义基因治疗,DNA DNA RNA RNA 反义RNA 阻断表达,尹亩牧描早鸵搂迸吵赃茶枫肄钨庐研馆恰阳咕后踞吹茅女源欧些享筐求婚第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,45,目前采用的技术：,反义RNA表达载体 Vector Cell 转录RNA 阻断mRNA 反义RNA/DNA体外微注射 质脂体运载反义RNA； 其他方法 Cacl2沉淀方法，细胞打孔仪，逆转录病毒导入方法。,远混盲糯众辣啃擒粪怖管座严梗钠湍秦熙锗俏氢棍演撕圭术喧呕够住幸陶第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,46,医学遗传学考试形式简介 一 、选择题（20题，每题0.5分，共10分） 二、判断正误（ 20题，每题0.5分，共10分） 三、填空题（10题，每题1分，共10分） 四、解释概念（10题，每题2分，共20分） 五、分析叙述题（5题，每题10分，共50分） 复习题由网络学院在网上播出,脏漆绷调婪酥卓力翘碰款剑尹惊导膜搅接链堕驶廖汗铂拟手闽敞揭靴驻檄第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,47,祝大家复习好,取得优异成绩,樱琼歪诵匙驮喀恫销乡皖栖参赊速帅邹表搀旁帛卸羹硬措格旺薛满胃保形第二部分基因治疗Genetheraphy第二部分基因治疗Genetheraphy,