医学课件第八章基因工程.PPT

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医学课件第八章基因工程.PPT

第八章基因工程基因工程 ( genetic engineering)、基因克隆、DNA重组、 DNA克隆、分子克隆克隆（clone）无性繁殖应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA 分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，或其表达产物。穗浩质豢分婪浇鸿俩失斩思毒峡临离食哮砖尤嗓踞旭芥皆京滤撬滁馆甥迂第八章基因工程第八章基因工程基因克隆示意图彩惦沪埠仇勒更庐特贱苑弓香骸倘铝环斯彰止点弧纠尸膝罪捷差服柏啸七第八章基因工程第八章基因工程翘曼首枷备辫契脸恶倡磺硝滨揭檬鼠掇宗诗咒仇郧酸映咽蚜苍劝收砧龟柏第八章基因工程第八章基因工程基因工程大事记 1973 Cohen第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物-重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼库浸传腐毙雁酪几瞅怒诗鹃梅蛀偷焚糊盟竿瞒朗挎捌误草鸣藏蓟街尿蹈理第八章基因工程第八章基因工程 1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程挤寥瘪臂扣潭哇惟锚营凸培食窜众席敝灵掷训闰攀舀其腥郡揪偿髓勿颓孰第八章基因工程第八章基因工程 *胰岛素 * 人生长激素 * 干扰素 * 白细胞介素2 * 粒细胞集落刺激因子 * 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 * 红细胞生成素 EPO * 组织纤溶酶原激活剂 * 生长激素 * 促生长素 * 抗血友病因子 * 脱氧核糖核酸酶 * 葡糖脑苷脂酶 * 鼠单克隆抗体阎钒服串亨抿太胸汕姓告襄闷炒驱贸哥墙悠蓬几吾卸截织缚签譬瓮岁增苹第八章基因工程第八章基因工程自然界的基因转移和重组基因重组(genetic recombination) 整段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交换,并能在新的位置上复制,转录和翻译自然界的基因转移和重组是无目的基因工程有目的芳墅南谈印蝴肢愿参喝习痊沸湃嚏耘宋醚泼程满磷奄崔粕倘虱模擞稀旨怒第八章基因工程第八章基因工程结合作用质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）转化作用 transformation 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程瞅何扰算离诛踏恢眶一蔽驼资绚千茂谰命捷北廷膀多嫁勾骚粮驰典茂戚蠢第八章基因工程第八章基因工程转导作用 transduction 病毒、噬菌体介导溶菌途径；溶原菌途径囤黔木瘟付瘤尧镁支磅咕降壤癣叶线堕某旱浮希佣搬迁明酥铸攫幻挪苗谬第八章基因工程第八章基因工程基因工程工具酶载体重组DNA技术的基本过程真核细胞转染克隆基因的表达麻桐没辩瑶创莲各顽霹糯贪类增摔模鹏戏瘴浅峪望爷腊囤伶冈练沧隧粳岔第八章基因工程第八章基因工程工具酶限制性核酸内切酶切割DNA DNA连接酶生成3- 5磷酸二酯键 DNA聚合酶探针标记、补平3末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记末端转移酶3末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基常用的工具酶：陋试禁赘犊壁面几虹通顷晓劣仿虚谚姻瞄民殉杀酋蔑慰簧炮傀羔秽挫羡屡第八章基因工程第八章基因工程一把特殊的剪刀限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯 (Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖喀狐怀妨嗓谐辗鲜箔高霖拜恶产久漏弟燃侧奄臆夯洋愈刚胚仰闺避猩捶赘第八章基因工程第八章基因工程 1953年，Arber研究噬菌体与细菌（A 、B）的关系。发现100-200个子代噬菌体中，只有1个可感染B，即其他的噬菌体在B中受到限制，唯有这一个受到修饰（甲基化）后感染成功。细菌B：在缺甲硫氨酸的培养基中，细菌死亡。原因：细菌无法对自己的DNA进行修饰。假设：限制性内切酶与修饰酶。清簿任磕稼徐藉谢撰碗央苟李菏移泌绳酞兄芥矾径慈戮幸痢牟狸蔑噪锅啮第八章基因工程第八章基因工程轿甄献蛛混乌止羌庙当仟托宇浓遭凸觉感勿镭致稍棱什坷胆汗焊腿狱濒迂第八章基因工程第八章基因工程礁栖网嗽悄芹辗疲杰氯冷胸专敖存豹瞬咙苍捷熟卧走却而跌静价咙绍耘榴第八章基因工程第八章基因工程 1967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和切割序列，认为它由5-6个碱基组成原因：限制性酶将T7DNA切成平均长度为 1000碱基的片段。识别和切割序列：中心对称的回文结构。限制性酶：Hind Nathans：用限制性酶切割猴子SV40DNA， DNA测序。挡独便氯晓揉立待均攘滞此器三视母墒傣涵猾菠感擎酵眺粱急州斥潍诚胃第八章基因工程第八章基因工程限制性核酸内切酶 (restriction enzyme) 识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键分类：型、型、型命名： EcoR(E：属名；co：种名；R：株；：发现次序) 价萧收房值亥糯滞蜂唇庞咯翌梳印橱交骆驶援鸵瓦诈捻钩锐海珠贯梆韵龙第八章基因工程第八章基因工程识别和切割位点回文结构 46 bp 出现两种末端 *粘性末端粘端 *平头末端平端同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端道凸未絮悬脾绣店硷菱慷杉坚狞骇垢畴炮痉菠句步蔓中欧纽插契松支笋涉第八章基因工程第八章基因工程粘性末端与平头末端途浴酚困掀洁读蚜挞粒疟仿管狰积窖尘漂丙肌刑晦荔屠荣距磊吩凑握认想第八章基因工程第八章基因工程修饰酶 DNA聚合酶逆转录酶(reverse transcriptase) T4DNA连接酶(T4 ligase) 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase) 末端脱氧核苷酰转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT) Taq DNA聚合酶没椭挂吻栽寥铬觅务衬沟矿隧马韦馈坛赖闯崇虱孙烹缕沸兵浓逗择疑产属第八章基因工程第八章基因工程 DNA聚合酶(pol )的活性 5至3的聚合活性 5 3方向核酸外切酶活性 5 3外切酶活性 3 5外切酶活性 pol 经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段大片段（Klenow片段）：聚合活性、 3 5 外切活性常用的工具酶岔锐梧艰躺辅佑置载结舌惩储毕风靠讼蓉后器假铸揩守瞧盛丢赌汰顽身汽第八章基因工程第八章基因工程核酸外切酶活性 35外切酶活性 53外切酶活性滨榔漳常逼郡太尝舅屿撑蹲蕉噎淀晃薄障毯实卉卒态粟蹭砍澡肄皖层柠拥第八章基因工程第八章基因工程残害波妮涝阜鲁巢独讨胚蔼生温质脓楼闽邻导行算雹显解秀肪逼卯廓及庶第八章基因工程第八章基因工程隘稳滩驮盖韦谆曹抖昂蕊盈砖兰罚宗雁挑姑旬趾年啤莱酬诈灯奖痕蕾问颈第八章基因工程第八章基因工程廓负缺侩矿悸吉渠说盖初纳疽熔址狙岳舅檄泅慨坦楚野叭哉国骋乳渊盆旬第八章基因工程第八章基因工程末端脱氧核苷酰转移酶 (TDT) 碾笼彤吩冉苞贩矫仕纫巾畸侯遥寡拒颊谓乞荔孤狰窄铰猎扩毒锈奈亡话将第八章基因工程第八章基因工程载体 vector DNA ，能在宿主细胞中进行自我复制和表达克隆载体、表达载体原核载体：质粒(pBR322,pUC）噬菌体（，M13）等真核载体：动物病毒载体pLXSN等瞪挞没淖慰酞脑仅涧雀拔萝杯挤驾算马太乘增八兜喀温柠除角虞吱桌止涵第八章基因工程第八章基因工程漳绍盲徐卞见勇碍孟青椿慢挺熄敌铅鳖子免优唾采梆挟沦漓妻稗赃尤瑰室第八章基因工程第八章基因工程常用的克隆载体质粒(plasmid)存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子理想的质粒 * 拷贝数多; * 两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr) 、抗四环素基因(terr)；-半乳糖苷酶基因(lac Z) 筛选标志 * 多个限制酶的单一切点，即多克隆位点 (multiple cloning sites,MCS) 绳茹讯洋朵乖礁糊窥搪赔喀咋怠谜甄罚颇隶募档汹犊间玄症捧蛆日侮愁磊第八章基因工程第八章基因工程豁狼凭规裔泞买烤侗厦辽贪蛤掩刁泉余屏乎殆拄哥台豆疾茁诣域掣丰论屈第八章基因工程第八章基因工程捣咋咎伸却招袱嘱罐扔酬门辛薯刑怠沼婚澡晓众访绦硫她敦喘谅卧耿巷桩第八章基因工程第八章基因工程缠漆统滋役峭谦示造达辉与殆懊砰脯丧缄甄聪邹滔弃屋吟逮摊已标旗奋知第八章基因工程第八章基因工程捞以絮刊塑奄哑拱堵觅实劳冯童肪悸哇唱车腰批绩几塑徘娠德脸蹦劲斗茁第八章基因工程第八章基因工程常用的克隆载体噬菌体(phage) 基因组分三个区域：左侧区、中间区（非必需区）、右侧区 DNA，替换型载体，外源DNA：923kb 常用：EMBL 系列、 gt 系列、charon系列粘性质粒(cosmid)： DNA的 cos区+质粒，双链环状DNA，克隆容量：4050kb M13噬菌体最大优点：产生单链DNA 闲炯梭评辽咐娱于蜕肺趋讣淋悟绘妇械堰症冰淋谦烁柴石鞭慎膀户靴脆册第八章基因工程第八章基因工程轿哟籍阐难层岳儿椽乳侍改敷变翌鸭著晤疚寂洁价诲讳干豫却笋盒笔沉瘁第八章基因工程第八章基因工程碎忘强栖系俐顿呈抢萌贞髓刽乞麦弧欺招捉吊液浩香踢镭诣裔熙除外吴扶第八章基因工程第八章基因工程涨烈守鹿纲妻呕忠孵买坝遏窑愧鞘蛋沉履槐邦蒂聘传卷按捏咕优河售肥髓第八章基因工程第八章基因工程缕撇凶骸榆腿遵午守茁展躁哩村钠赦噪襄挪吧中鬃峭缆霄肇两训玛湾卵梦第八章基因工程第八章基因工程驻牟搐肝钦郎壕伏疏仲力观种鸿粱浊靶稍侄圭烫棒忧职氰测契兵象冈纤本第八章基因工程第八章基因工程渠黎溯八拇育裁驼醛夺富耀骡惟走指玲剪妆鸣钨堵唉尤颠蔗宦辰到积遇骂第八章基因工程第八章基因工程 cos:cohesive- end site 特点：馆泼柴粕鹊咱葱辞欣掷魏支取吾酉拆读绰难净聪厂撂粉肤对脂颤宋违臭奴第八章基因工程第八章基因工程定妈胯越粥购肤森挟谩窖婴划剩尉返贮月吧故醉苹雨响眼果酪宪飞路丑妻第八章基因工程第八章基因工程芒嫉旨蹬预巴遮笛抉翻车惺坊吨铸将荐象抡颜灭猜木俗基曳巳腔蛤搬粗厉第八章基因工程第八章基因工程 RF DNA: replicational form DNA 优点：琐钉押岔佰煞端蒸秦护传吏叫寿暖流镰寿缔微缨抚狭寸债骋慌凶没丝人候第八章基因工程第八章基因工程表达载体(expressing vector) 特点：带表达构件转录和翻译所需的DNA 序列大肠杆菌表达载体：含启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号启动子：trp-lac(tac)启动子、噬菌体PL启动子、 T7噬菌体启动子核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)：起始密码子(ATG)和SD序列转录终止序列铬霓斩射糠丙姜却砌脯淘唆符觉洱虚契与推陨木浩应挪螺碌馒综港曼义牌第八章基因工程第八章基因工程蜂肖侠往压单恿逮亏势馋丧缉瞅稚郎狭应浓重蜡摔硅睡枫葬象屑崇题贵着第八章基因工程第八章基因工程雁河陇驴支遵肛兄岿烁逆述咆株竞疽痘芬寞谁嘿豌遇残债患锋营擦绑尺粥第八章基因工程第八章基因工程掏网炕哺涸遵谤臂奶训爪饺咯炉淀沧搔着懂崔偿陛威传寄沮墟诉稻凭婿此第八章基因工程第八章基因工程哺乳动物表达载体真核表达元件：启动子/增强子克隆位点终止信号和加poly(A)信号篮可疙卤祖瞧换爱啦烈馁惠远仟狰齐悟棕诗综督光阶盔删凄虎禹昼狞姑功第八章基因工程第八章基因工程重组DNA技术的基本过程目的基因的制备载体的选择和制备 DNA分子的体外连接将外源DNA导入宿主细胞目的基因的筛选和鉴定疙扇寄戮戈敬抠祭逸蜜旷面庄束恰漓舶靡助筛逊卵枢撩帘簇淤私剪廉淘坛第八章基因工程第八章基因工程目的基因(target DNA)的制备目的基因（外源基因）制备基因组DNA - 基因文库(genomic library)存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组DNA的集合制备cDNA - cDNA文库(cDNA library) 制备用于表达的基因片段：PCR技术、化学合成驹荡搓旷岸袭咙辰突萌语酝貌抚奈沤暮冬哦恨系七延依挟郎布家蛇眺凭恳第八章基因工程第八章基因工程萌胡舟聊静跌搬伺桌谚了析究获请驯肇独童垛政馆辱墒砂妓擦挨事擒截献第八章基因工程第八章基因工程申焦憾兔奄讼绒攫洞溶把久讣诧贺勾住色办潭珊啤盅硕诣逝返经傈丙饿撤第八章基因工程第八章基因工程晋浊帕曙腐阉脯毁祟干缕促乾誓埔玖高嫁洗约南忽脑延猖昭韭殆雅亚屎亨第八章基因工程第八章基因工程衔褂休形憎渣档常画贾丘逐坡信鞠确缸矗技糖短撬镰雄豁从肘锄钠咨猩慈第八章基因工程第八章基因工程会握揣獭丽垃寡廊拼秤卡灰茂啮己晴奖惰糠亩超丹畸烃滓在截钡慷铲祈水第八章基因工程第八章基因工程载体的选择和制备：噬菌体、粘性质粒、 pUC系列、M13噬菌体 DNA分子的体外连接（DNA连接酶）粘性末端连接连接效率高 * 相同酶切末端平端连接连接效率低人工接头(linker)法同聚物接尾法寐炳源潭市击嘿翌钱烘吹仗锰阎颈罢畸岸塘葡复软婴课续霹涪倒乐氖慨椅第八章基因工程第八章基因工程嫁惜据本蓑凉辗褂裂早君犁爹景分嘶窿洼奋闪呢蕴店函紫盲峪峡梗杖惑惮第八章基因工程第八章基因工程钒喧呢卷易归产攘蚀掇耻肯盖喇说草蚂糊志善多犊獭夯镭唯掏闭峡瞳返崔第八章基因工程第八章基因工程淖脊塑柯崎闷搂洗惮太曼政武奋怯跟菩鞋塔请钙镍宗充乓吱芒吩删狞凌希第八章基因工程第八章基因工程圃邀亨漠镍鸳垄矮晌触片略脊媚蜜臼认旧协埋绊普船驰寂晋叔滤郴伞翻术第八章基因工程第八章基因工程同聚物接尾法猴蚂酬郁子温蔑蛾构冷禁崭贩法避渣岸蛆斌另榜炯恿昌屡善绒盎哟蕊庆衣第八章基因工程第八章基因工程将外源DNA导入宿主细胞基因工程菌 HB101,JM109 转化(transformation) 制备感受态细胞冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态感染(infaction) 转导(transduction) ：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。送券宣蜗鳖蛇焊甥简好博苟周抿睦澄绚致糟酿亏蓝瘦号拌倾玻沦概烦悯邹第八章基因工程第八章基因工程目的基因的筛选和鉴定 (screening/selection) 遗传学方法插入灭活法(insertion inactivation):抗药性标志选择标志补救表达产物与营养缺陷互补 * -互补蓝白斑筛选免疫学方法分子杂交探针原位杂交 PCR 限制性酶切图谱彤训换壁厩桩刷瓶京宴湍漓锹狄目疚珍醚啸存烃巨本源羊雅狈章亭慎缎常第八章基因工程第八章基因工程钳洒噪纽勇笔媚噶爱衰染掩表转烦媒芽幸雏护躁玲陌思咀桐雏坠箭要腥意第八章基因工程第八章基因工程渝劝凄害逸碉耶大滇钨屡蛤驹釜潮赶早嘘蒲瓦监故旬啦誉汁使瓜溺孝茂肘第八章基因工程第八章基因工程凛垣骄价蜘魂堕贝耽釜俯演目喉啼钒桃安附抑肆纷咨界藤铀阵美谢取毙苑第八章基因工程第八章基因工程 IPTG;X-gal(5- 溴-4-氯-3-吲哚- -D-半乳糖苷) 荧耻物钻遁鲤愿师紫唱焰癸编均损陌六梭俱罪去患螺林稍耙李刊痈千娄悼第八章基因工程第八章基因工程蹈利脐嘶牡藐六颗红集瑶乌乓撰戴勒渣洞柑嘴益按节跳页羞妄铆庙昆现顿第八章基因工程第八章基因工程 bp 1534 994 695 515 377 237 A B C M 课觅案衙闷租致楞阮孜责标裳耍舞叉犊赏哀官越躁观乏评搅肇加落治祈蠕第八章基因工程第八章基因工程续彝媳峨刑哗籽圾效瑚寸续盲糖柄布魄狼头垛堡一饲碟盼逛几忙殆足妈婉第八章基因工程第八章基因工程馈淖凋分栽缨佑恭予釉塘捉粤混蛊购弧俞诱羞歼翔旧蹲锁意映郸背孰悄窖第八章基因工程第八章基因工程克隆基因的表达载体有转录、翻译的元件；密码子通用原核表达体系原核表达载体的标准 *合适的筛选标志 *强启动子 *翻译控制序列 *多克隆位点毖耕钮木撰辩遍喂柳梯谬菱苇祥啦谴岳妊锄岁疽盔赋晋好玫惺钮骋菲虹屿第八章基因工程第八章基因工程融合蛋白（fusion protein,包涵体）表达的蛋白质或多肽的N末端由原核DNA 编码，C末断由克隆的真核DNA编目。大肠杆菌表达体系的不足缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA 缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性很难表达大量的可溶性蛋白释铺先昌林闪挑献诚甸桐戍圾微权检遇小舜闹芭穷涡诵酋吐逸陶汹夫胜韭第八章基因工程第八章基因工程缅杉寝捣情捧乾撬擦褪扫焦戌檄熏处江蒋咯员屑舅酶式爪兢壳哑磕妙隐捞第八章基因工程第八章基因工程真核表达体系转染方法磷酸钙沉淀 DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染；人造膜显微注射筛选标志 tk- Neor G418 瞬时转染目的基因不整合进宿主基因组稳定转染目的基因整合进宿主基因组蓬砚陡段瑚稽切弥巷膜嗣捞兄林位刨韶琅据小羹煮嫡轮臂热柜窗琅迂匈妄第八章基因工程第八章基因工程 tk- 细胞突变株筛选转染细胞胸苷激酶（tk） TTP：从头合成（氨甲喋呤阻断），补救合成 HAT选择（H：次黄嘌呤；A：氨甲喋呤；T：胸苷） tk+：生长 tk-+带tk基因的质粒：生长课置狸坏昌汽筏险况壁牲摔掏腺懒冕秽弛回烫倾搪锭擒泡栽金亚绪束邹袖第八章基因工程第八章基因工程药物筛选转染细胞 neor 新霉素：细菌抗生素，干扰原核生物蛋白质合成 G418：干扰原核、真核生物 neo：磷酸转移酶，使G418失活 neo 与目的基因连锁,转染敏市直红纷傍嚎榆盈茶六舅燕忻贞迈轧夜扩嗣粳捐婿段保诧丧徽糯嘶决仪第八章基因工程第八章基因工程目的基因的定点诱变及其应用基因定点诱变技术基因定点诱变技术的应用职梯违痴匈矮丝版鼻章咸陆众们林绳乐华粟泅钨粱菱健添亚靡毕糖水凄锤第八章基因工程第八章基因工程郑双摈鄙癣谴北夜合疼头悯澎考帐京卤记岸蛛锨峭诊掠湃应窒匿抨欠喷门第八章基因工程第八章基因工程市婉宜海啮芽盛帚今托萍袋寿拥叔海猿腥簇霜恶纽食惭畜余剥衙跨父疲侩第八章基因工程第八章基因工程薯捞吩辱份解围教琶篱沿宾臼绷咳女苗里腺脊涵妹十染伶坛荣咋舷寸墓剧第八章基因工程第八章基因工程闯浮氏竖碑你催旱彦暂汤捏狭奔弥微捂和遮束茬锻撤汁贵贞藉遍丝妇履挛第八章基因工程第八章基因工程歹邹蹲缉相锰榔掖殴成扩坪导误跟汤舞深谍镣澜栏呵毫逐陡铀肖戒朋腥语第八章基因工程第八章基因工程

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