不同方法检测急性呼吸道感染患儿咽拭子与鼻拭子标本诊断呼吸道合胞病毒感染的评价.doc

不同方法检测急性呼吸道感染患儿咽拭子与鼻拭子标本诊断呼吸道合胞病毒感染的评价2011年3月2012年2月采集广东省中医院急诊及广州医科大学第一附属医院儿科315份符合呼吸道感染诊断患儿的咽拭子及鼻拭子。 1.4标本采集及处理 1.4.1咽拭子标本采集方法 采集前需摆放好患儿体位，以免在采集咽拭子时因咽部刺激而大量呕吐，污染标本。使用压舌板压住患儿舌头，用无菌棉签刮擦咽侧壁及咽后壁，将采集后的拭子置于病毒运送培养基中，以冰盒运送至实验室，放-80保存。 1.4.2鼻拭子采集方法 拭子以耳垂与鼻尖方向插入鼻孔36 cm，使拭子在鼻内停留15 s，然后轻轻旋转3次，放入病毒运送培养基中，以冰盒运送至实验室，放-80保存。 1.4.3标本准备 标本使用时，室温复温，在振荡器上充分混匀拭子标本，将拭子于试管管壁反复挤压、挤干液体；液体经4、3000 r/min离心10 min，去除上清液，取沉淀物备用。 1.5病毒培养与免疫荧光鉴定方法 1.5.1病毒培养 每个细胞培养管接种标本上清液0.2 ml，作复管，以RSV Long株为阳性质控对照，同时设立细胞阴性对照。标本36吸附2 h后，弃去上清液，加入含4%胎牛血清的病毒培养液2 ml/孔，继续培养68 d。每天观察细胞病变（CPE），单层细胞出现局部大而形态不规则的细胞融合，形成多核巨细胞时则判断为CPE阳性。进一步作免疫荧光法进行鉴定；阴性标本盲传12代后以上述方法进行确认。 1.5.2免疫荧光法鉴定 吸取细胞管的上清液仅留少数几滴，将细胞从管壁刮下，取细胞悬液15 l至多孔玻璃片待干备用，免疫荧光染色方法按照试剂说明书进行，正置荧光显微镜下观察，细胞内特异性苹果绿荧光视为阳性。 1.6 qPCR 1.6.1 RNA的提取 采用荷兰qiagen公司生产的qiagen viral RNA mini extraction试剂盒从拭子标本中提取病毒RNA，按试剂盒操作说明书进行。 1.6.2反应体系与条件 引物和探针序列见表13。扩增的引物基因区段如下。扩增反应体系参见说明书；扩增条件：45 10 min，94 10 min，94 30 s，共45个循环；60 1 min。 1.6.3检测结果判断 Ct值 综上所述，在临床实践中对急性呼吸道感染患儿的病毒检测推荐使用鼻拭子标本，使用qPCR方法是实现病毒检测的快速方法，值得进一步在临床实验室应用、推广及探索。