1、ICS11.220B 41DB四川省地方标准DB X/ XXXXXXXXX猪盖塔病毒分离与鉴定技术规范Technical Specification for isolation and Identification of swine Gaeta virus点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施四川省市场监督管理局发布DBXX/ XXXXXXXXX目次前言II1范围12规范性引用文件13引导语14试剂与设备14.1试剂与耗材14.2主要仪器设备15样品的采集、保存与运输25.1猪只临床发病特征25.2临床样品的采集25.3保存与运输26病毒
2、的细胞分离培养26.1样品的处理26.2制备单层细胞26.3接种细胞26.4病毒收获37病毒核酸鉴定37.1RNA的提取37.2反转录（cDNA的合成）37.3PCR扩增38结果判定48.1RT-PCR48.2病毒分离鉴定4附录A（规范性附录） 试剂配制（规范性附录） 试剂配制5附录B（资料性附录） 猪源盖塔病毒简介和CAP基因扩增序列6前言本文件由四川省农业农村厅提出。本文件由四川省市场监督管理局发布。本文件主要起草单位：四川省动物疫病预防控制中心、四川农业大学。本文件主要起草人：陈斌、朱玲、陈弟诗、周明忠、徐志文、邓飞、邵靓、李丽、周莉媛、张睿、谢嘉宾、王英、文豪、徐凯、黄先奇、陈亮、张国
3、华、李莎莎、孙贤刚、江朝源本文件由四川省农业农村厅归口并负责解释。6猪盖塔病毒分离与鉴定技术规范1 范围本文件规定了猪源盖塔病毒分离与鉴定方法。本文件适用于猪及其产品中盖塔病毒病原分离和鉴定、实验室诊断、监测和流行病学调查等。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB 19489实验室生物安全通用要求NY/T541-2016兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范3 缩略语下列缩略语适用于本文件。GETV：盖塔病毒PB
4、S：磷酸缓冲液DMEM：细胞营养液FBS：胎牛血清HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸BHK-21：乳仓鼠肾源细胞CPE：细胞病变DNA marker：DNA相对分子质量标记RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应4 试剂与设备4.1 试剂与耗材4.1.1 所用生化试剂均为分析纯；按GB/T6682（所有部分）一级水要求实验用书应经灭菌或采用超纯水；4.1.2 RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、2PCR混合液、1%的琼脂糖凝胶、DNA相对分子质量标记（100bp2000bp）；BHK-21、DMEM培养基、FBS、HEPES缓冲液(1mol/L储存液)、25cm2细胞培养瓶、0.22m的一次性滤头、0.
5、01mol/LpH7.07.4PBS(参见附录A)；4.1.3 阳性对照：GETV标准毒株；阴性对照：BHK-21细胞培养上清。4.2 主要仪器设备微量移液器、组织破碎仪、组织研磨器、核酸提取仪、PCR仪、通用型电泳仪、凝胶成像系统、倒置生物显微镜、37恒温培养箱、冰箱（28、-20、-70）5 样品的采集、保存与运输5.1 猪只临床发病特征在蚊虫多发季节，即每年5月至10月，猪只已正常免疫猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等疫苗，其新生仔猪出现腹泻、厌食、皮肤红变、舌颤、肢体不协调，10日龄以上小猪出现精神颓废、发热、食欲减退、日增重显著下降和妊娠母猪出现繁殖障碍综合征等临床症状
6、时，均可认为疑似猪盖塔病毒感染。5.2 临床样品的采集采取疑似猪盖塔病毒感染的淋巴结、胎盘、羊水、死胎、肺、肝、肾、小脑等靶组织约25g或血液样品12mL，组织装入无菌自封样品袋或离心管，血液装入抗凝血管中，编号。5.3 保存与运输采集的样品应按照兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范（NY/T541-2016，所有部分）要求包装和运输，尽快运送到实验室。样品在28条件下保存应不超过24h；若超过24h，应放置低于-20冰箱，不宜反复冻融。6 病毒的细胞分离培养病毒分离应按照实验室生物安全通用要求（GB 19489，所有部分）在生物安全二级实验室进行。6.1 样品的处理6.1.1 组织样品取0.
7、51g待检组织样品，加入11.5ml PBS，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，或用组织破碎仪充分破碎，用含青、链霉素的DMEM作31（V/W）稀释。反复冻融3次后，4 3000r/min离心10min，取上清液，以0.22m无菌滤膜过滤除菌后，转入1.5mL离心管中编号，-70保存备用。6.1.2 血液样品用含青、链霉素的DMEM作31（V/W）稀释。反复冻融3次后，3000r/min离心10min，取上清液，以0.22m无菌滤膜过滤除菌后，转入1.5mL离心管编号，-70保存备用。6.2 制备单层细胞按常规法将BHK-21细胞分装在25cm2细胞培养瓶中，每瓶分装含8%FBS的DMEM培养基5
8、mL，细胞浓度应为2105个/mL3105个/mL，培养48h。6.3 接种细胞取6.1中的上清液0.2mL接种到生长状况良好的单层BHK-21细胞上（5mL工作体积）。每份样品接种2-4瓶细胞，另设细胞对照2-4瓶。37C吸附1h，弃上清，加入2ml含2%FBS的DMEM培养基，37、5%CO2条件下培养48h。6.4 病毒收获每天观察记录细胞病变（CPE），若被检样品中有GETV，通常在接种1248h内可出现CPE，感染BHK-21细胞后约12h，细胞出现空洞；24h后细胞明显变圆，部分开始脱落；36h后大量脱离，贴壁细胞大部分变圆。对照细胞单层应完好，细胞形态基本正常或稍有衰老。若出现C
9、PE，将接毒细胞反复冻融三次，4 3000r/min离心10min，收获病毒上清液，置-70保存，进行病毒核酸鉴定。若接种细胞第1代72h后未出现CPE，按上述收毒方法收获细胞/病毒液再接种生长良好的单层细胞进行盲传，即1mL第一代细胞/病毒液加4mL细胞维持液，37培养。如此盲传3代，再进行鉴定。7 病毒核酸鉴定对6.4中收集到细胞/病毒液，或经6.1处理后的临床样品，用RT-PCR方法进行核酸鉴定，可使用商品化的两步法或一步法RT-PCR反应试剂盒，本标准推荐使用两步法RT-PCR反应试剂盒。7.1 RNA的提取选择商品化RNA柱式法或磁珠法提取试剂盒，按照说明书提取RNA，同时应设立阳性
10、和阴性对照样品。RNA提取操作应在通风柜或生物安全柜中进行，避免RNA气溶胶的污染。7.2 反转录（cDNA的合成）配制反转录反应体系，使用商品化反转录试剂盒将7.1中提取的RNA反转录成cDNA，具体操作、体系参照说明书进行，cDNA于-20保存备用。7.3 PCR扩增7.3.1 PCR引物上游引物（10mol/L）：5-ACCGAAGAAGCCGAAGAA-3下游引物（10mol/L）：5-GCACTCRAGGTCATACTTG-37.3.2 PCR反应体系反应体系见表1。表 1RT-PCR反应体系PCR反应试剂总体积10LL2TaqPCRmaster Mix5上游引物（10 mol/L）
11、0.5下游引物（10 mol/L）0.5cDNA模板1ddH2O（无菌水）37.3.3 PCR反应程序反应程序见表2。表 2RT-PCR反应程序步骤时间和温度min、s/循环数个预变性5min/951变性30s/9535退火30s/56延伸30s/72延伸7min/7217.3.4 琼脂糖凝胶电泳成像PCR扩增结束后，取适量扩增产物加到1%的琼脂糖凝胶加样孔中，并加入阳性、阴性对照和DNAmarker。使用电泳仪进行电泳，电压大小根据电泳槽长度确定，一般控制在4V/cm6/cm，电泳时间为1020min。电泳结束后，将凝胶放在凝胶成像仪中观察记录成像结果。8 结果判定8.1 RT-PCR8.1
12、1 成立条件对照成立，即电泳结果阳性对照在316bp左右出现目的DNA条带且阴性对照无条带。8.1.2 阴性判定电泳结果未出现与阳性对照316bp一致的DNA条带，判定为：GETV核酸阴性。8.1.3 阳性判定电泳结果出现与阳性对照316bp一致的DNA条带，判定为：GETV核酸阳性，对扩增条带进行测序，其结果与附录B.1序列比对，进行确认。8.2 病毒分离鉴定8.2.1 细胞发生CPE、核酸鉴定结果为阳性，且测序比对结果正确，则判定为：GETV分离鉴定阳性。8.2.2 若盲传3代后，细胞并未发生CPE，但核酸鉴定结果为阳性，则继续盲传至5代后，在进行核酸鉴定，若核酸鉴定结果仍为阳性，且测序
13、比对结果正确，则判定为：GETV分离鉴定阳性，若核酸鉴定变为阴性，则判定为：GETV分离鉴定阴性。8.2.3 若盲传3代后，细胞并未发生CPE，核酸鉴定结果为阴性，则判定为：GETV分离鉴定阴性。AA附录A （规范性附录）试剂配制（规范性附录）试剂配制A.1 0.01mol/L pH7.0-7.4 PBSNaCl8gKCl0.2gNa2HPO412H2O3.58gKH2PO40.27g灭菌双蒸水800mLNaOH或者HCl调pH值7.0至7.4，灭菌双蒸水定容至1000mL,121、15min高压锅灭菌冷却，置常温或4备用。A.2 电泳缓冲液 TAE（50倍）三羟甲基甲烷碱（Trisbase）
14、242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L（pH8.0）乙二胺四乙酸（EDTA）100mL蒸馏水100mL待上述混合物完全溶解后，加蒸馏水至1000mL，置4冰箱中备用，如配制1%的琼脂糖凝胶和用作电泳缓冲液，则用蒸馏水稀释50倍，成TAE电泳缓冲液。A.3 1.0%琼脂糖凝胶板制备琼脂糖1.0g1TAE缓冲液100mL0.5ug/mL溴化乙锭5uL微波炉充分溶解后，加入溴化乙锭，倒入凝胶板中，在距离底板0.5mm的位置上放置梳子，凝胶的厚度为4mm，待凝胶完全凝固后，小心移去梳子，将凝胶板放入电泳槽中，电泳缓冲液没过胶面。BB附录B （资料性附录）猪源盖塔病毒简介和CAP基因扩增序列B.1
15、猪源盖塔病毒简介盖塔病毒（Getahvirus）广泛分布在欧洲、亚洲、大洋洲是披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（Alphavirus）成员。该病毒粒子呈球形，有囊膜及纤突，直径约70nm，单股正链RNA，病毒基因组全长约1112kp，编码区包含2个独立开放阅读框ORF和ORF2；ORF1长约7407bp，编码4种非结构蛋白NSP1、NSP2、NSP3和NSP4；ORF2长约3759bp，编码5个结构蛋白Cap、E3、E2、6K和E1。衣壳蛋白Cap基因全长804bp，该基因高度保守、对病毒颗粒的形成和存活至关重要，常被用作该病毒的检测、鉴定。1955年Scherer等首次在马来西亚
16、橡胶林中生存的白雪库蚊(Culexgelidus)中分离得到该病毒，GETV可感染多种动物并引起马和猪发病，其症状表现为发烧、荨麻样皮疹和后肢水肿，实验室条件下，GETV能够感染兔、小鼠、豚鼠和仓鼠等，并能够引起新生乳鼠死亡。在动物尸检中，一般表现为肾脏畸形、肾脏表面有斑点出血，肠壁薄、有空泡半透明，全身淋巴结充血肿大，除此之外可能在其他器官未能观察到大体病变。自2017年我国首次在河南省感染猪群中检出GETV以来，四川、云南、湖南等地猪群也报道发现此病，湖南省发生大规模猪群感染GETV引发大量流产导致重大经济损失，表明该病毒在我国已广泛分布，对我国生猪养殖产业发展带来困扰，造成巨大经济损失。
17、中国有关GETV研究主要集中于蚊源GETV检测和病毒分离，不同动物包括猪、羊、鸭等动物的血清学调查，在流行病学研究中发现GETV易与猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型和3型（PCV2和PCV3）、猪非典型瘟病毒（APPV）等病毒混合感染的情况。最近两年，GETV在不同宿主之间的疫情在迅速蔓延，对于马和猪，GETV尚无特效治疗方法。B.2 猪源盖塔病毒CAP基因扩增序列ACCGAAGAAGCCGAAGAAAAAGCCGCAAAAAGCGAAGGCTAAGAAAAACGAACAGCAAAAGAAGAACGAGAACAAGAAACCACCACCTAAGCAGAAGAACCCGGCTAAGAAGAAGAAACCAGGAAAAAGGGAACGCATGTGCATGAAGATAGAGAATGATTGCATCTTCGAGGTCAAGCTTGACGGTAAGGTCACGGGATACGCCTGCCTAGTCGGGGATAAAGTGATGAAGCCGGCACACGTCAAAGGTGTGATCGACAACCCCGACCTAGCGAAGCTTACCTACAAGAAATCGAGCAAGTATGACCTTGAGTGC_
