加拿大生物化学家-史密斯.doc

加拿大生物化学家-史密斯M.Smith于1932年出生于英国，毕业于英国曼彻斯特大学，1956年移居加拿大。现任加拿大温哥哥华大不列颠哥哥伦比亚大学生物技术实验室主任。1978年发明了寡聚核苷酸定点诱变技术。这一方法被用来在体外对已知的DNA片断内的核苷酸进行转换、增删的突变。这就改变了以往的对跗物质DNA进行诱变时的盲目性和随机性，可以根据实验者的设计而有目的地得到突变体。应用寡糖核苷酸进行DNA的定点诱变时，首先要把含有待突变的DNA片断克隆到M13噬菌体载体中。M13噬菌体的正链可以感染具有性纤毛的细菌，并在菌体内进行复制后，以出芽的形式形成新的带有正链DNA的噬菌体。而存留在菌体内的则是双链状态的复制型M13，受M13噬菌体感染的细菌生长速度减慢，在细菌培养皿上会形成较透明的噬菌斑。将目的DNA插入到复制型M13的多克隆位点上，去转染细菌，提取单链DNA作为突变的模板。根据需要市内电话合成带有突变核苷酸序列的寡聚核苷酸引物，使之与带有目的DNA的单链M13模板杂交，然后加入DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸，使杂交上的突变引物延伸，并用DNA连接 酶使新合成的DNA成环，再去转染细菌。可用DNA序列分析方法从得到的噬菌体中筛选出带有突变DNA相应的区段 ，从而得到完整的DNA突变体。利用寡聚核苷酸定点诱变技术，可以人为地通过基因的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质，从而可以研究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋白质分子之间的相互作用。目前，利用寡聚核定点诱变来进行酶及其它一些蛋白质的稳定性、专一性和活性的研究，已经有很多实例。例如，对胰蛋白酶的功能的基团的研究、高效溶栓蛋白类药物的研制、白细胞介素2结构与功能的分析等等。可见，它为酶的工业化以及临床应用开辟了新途径。因此，作为分子生物学中的一个热门领域的蛋白质工程，其研究方法和途径都离不开寡聚核苷酸定点诱变方法。