普洱茶的化学成分及生物活性研究进展.doc

普洱茶的化学成分及生物活性研究进展普洱茶是我国的特种茶类，以云南特有的大叶茶Gamellia sinensis（Linn.）var assamica(Masters）Kitamura为原料经特殊后发酵工艺生产而生成。从形态特征的进化程度来看，普洱茶比茶原始，至于拉丁名中的“assamica”纯属命名问题，与原产地无关。由于具有独特的风味和逐渐被人们认知的保健功效，普洱茶受到了国内外越来越多瞩目和认可。本文从化学成分和生物活性角度出发，探讨普洱茶的化学成分以及生物活性的研究进展。1普洱茶的化学成分研究进展11 普洱茶的原料晒青毛茶的化学成分普洱茶的原料不是茶鲜叶，而是由云南大叶茶的略粗老叶片加工制成的晒青毛茶。晒青毛茶与红茶加工原料的高效液相色谱图非常相似，多酚类中的主要成份为ECG、EGCG及；周志宏等从晒青毛茶中分离鉴定出21个化合物（41个化合物如图1所示；化合物17；910；1217；19；2123；28；30）；张雯洁等从云南“生态茶”（云南大叶茶经过常加工而制成的绿茶）分离鉴定出11个化合物（化合物16；16；1819；21；30）以及1个混晶体（芦丁和山奈酚3芸香糖甙的混合物）。他们分离鉴定了一些共同的化合物，比如茶棓素（化合物21），小木麻黄素（化合物19），简单儿茶素（化合物16）等，其中茶棓素在印度产的红茶中含量甚丰富，推断阿萨姆种茶鲜叶中的茶棓素可能是大叶茶的一个特征。云南茶树种质资源中茶多酚含量很高，云南大叶种茶树鲜叶原料的水浸出物含量，茶多酚、儿茶素、咖啡碱、茶氨酸，多糖等生化成分都高于一般中小叶种茶树，氧化基质十分丰富，构成了普洱茶品质形成和后发酵过程中特殊化学成分形成的最重要物质基础。1.2 普洱茶的化学成分到目前为止，国内外对普洱茶的植物化学研究很少。我们曾从云南双江普洱茶中分离鉴定出11个化合物（化合物13；911；1214；16；20），主要有简单儿茶素，简单酚性化合物，黄酮类化合物以及黄酮类配糖体等；另外周志宏等从云县普洱茶中还分离得到12个化合物（化合物24；8；11；16；2427；2930），其中4个是特征性的金鸡纳素型氧化黄烷醇类内脂化合物，有两个为新化合物（两个新的8C取代黄烷3醇化合物），命名为普洱茶素（puerinS）A和B（化合物24；25）。普洱茶中化合物的检测分析方面研究相对较多。简单儿茶素化合物和黄酮类化合物：普洱茶中含有非常少的儿茶素，儿茶素含量以及总量等远远低于绿茶、乌龙茶以及红茶中对应组分差异达到极显著水平（=0.001）；但没食子酸含量相对较高。普洱茶中不含有甲基化儿茶素类化合物，但发现有杨梅素等黄酮物质的存在，我们以前的研究中也证明了这一点；普洱茶提取物巾的儿茶素成分可能以EC为主1，其他儿茶素，尤其是EGCG，含量极低或者HPLC基本检测不到；Yuerong Liang”等研究发现，所分析的7个普洱茶样品的平均儿茶素总量只有8.41mg/g；有的检测结果甚至更低，可能与贮存年限以及加工工艺有关；但利用LCMS能检测出普洱茶中一些儿茶素的单体化合物和茶黄素等化合物，有20种化合物得到了初步鉴定；尽管加工原料的HPLC图谱相似，但普洱茶不具有红茶的图谱特征。我们实验室对云南近五十个普洱茶的研究分析表明，普洱茶中的没食子酸含量在12之间。但相比之下，CARMEN CABRERA等的研究中没食子酸（0.04mgg）和咖啡碱（7.5mgg）含量偏低很多，可能是样品差异或者是检测方法的误差所致，不排检测数值除错误的可能性。微量元素：CARMEN CABRERA等对普洱茶中的微量元素（Cr，Mn，Se, Zn）进行了分析，发现普洱茶中的铬含量（371.4mgg）高于其他茶类的检测茶样，而锰，硒，锌的含量（分别为431.7、55.0、65.1mgg）总体上与其他茶类相差不大；J.CAO等发现所检测的普洱茶样中水溶性氟的含量是77 mgkg，并且贮藏时间至少为25年的普洱茶往往比那些贮藏时间短的普洱茶氟含量低。他汀类（Satins）：L.S. Hwang等首先在普洱茶中发现洛伐他汀（lovastatin）（化合物31）；随后，DengJye Yang等研究指出洛伐他汀是在普洱茶中发现的唯一的他汀类化合物，在普洱茶的水提取物中有内酯环结构和羟基酸结构两种存在形式，而在乙酸乙酯提取物全部以内酯环结构存在。挥发件成分：晒青毛茶的主要香气成分为芳樟醇，其次是松油醇，香叶醇（化合物3335）及其衍生物；渥堆过程中形成了大量芳香族化合物，如1，2，3三甲氧基苯（化合物3839），是普洱茶香气成分的重要特色；许多有典型霉味和陈香的物质，如1，2二甲氧基4甲基苯（化合物40）等，渥堆茶中的化学成分可能通过霉菌的作用发生甲基化反应而形成。从晒青毛茶原料到成品普洱茶的加工过程中，存在于晒青毛茶中低沸点的醛酮化合物明显减少，然而萜醇类化合物例如芳樟醇及其氧化物（化合物3537）、茴香醚及其衍生物、吲哚等含量显著增加；YUerong Liang等研究指出，在所检测的17个挥发性化合物紫罗兰酮（化合物32）和芳樟醇氧化物是普洱茶中含量最丰富的挥发性成分。13 普洱茶化学成分形成与微生物的活动休戚相关微生物的发酵作用在云南普洱茶品质形成中起决定性的作用，是云南普洱茶品质形成的必要条件，离开了微生物和湿热作用，晒青绿茶是难以形成普洱茶特有品质风格的。在渥难过程中由于湿热和微生物生长活动引起的降解作用，产生了一些影响普洱茶品质的芳香特性化合物，而黑曲霉菌在这些化合物的形成过程中起了决定性的作用。云南普洱茶渥堆过程中主要微生物有黑曲霉（Aspergillus niger）、青霉属（Penicllium)、根霉属（Rhizopus）、灰绿曲霉（Aspergillus gloucus）、酵母属(Saccharomyces)、土生曲霉（Asperfgillus terreus）、白曲霉（Asergillus candidus）、细菌类（Bacterium），其中黑曲霉最多；但最近陈可可等从云南省易武、基诺山、普洱和昆明后发酵加工生产的普洱熟茶堆中分离到7种曲霉菌，并没有分离到黑曲霉； 同时指出，在普洱熟茶原产地的传统加工工艺中形成的普洱熟茶特殊的品质和风味，很可能与臭曲霉和日本曲霉的作用有重要的关系。14 普洱茶加工和贮藏过程中的化学成分变化普洱茶加工过程巾，没食子酸含量显著增高而茶氨酸含量显著降低；尤其在普洱茶渥堆结束时，茶多酚、儿茶素、茶黄素、茶红素、氨基酸以及可溶性糖等含量均剧烈地下降，而茶褐素和水不溶性茶多酚含量明显增加，但渥堆前后水浸出物含量并未明显下降，说明茶叶内含物通过氧化、降解、缩合等反应已产生新的生成物；成品普洱茶中的茶多酚和可溶性糖等随着贮藏时间的延长和贮藏温度的提高而有所下降，9左右含水量最有利于普洱茶品质风格的形成；虽然普洱茶在渥堆和贮藏过程中易受微生物的污染，但在0.51.0 kGy辐照下能彻底杀灭螨虫，而对茶叶主要理化成分无不良影响；辐照后普洱茶中的氨基酸、可溶性糖、茶多酚总量以及茶多酚的氧化产物，一般都有所增加，但咖啡碱、儿茶素（特别是脂型儿茶素）含量有所下降。2. 普洱茶的生物活性研究进展。2.1 普洱茶的安全性评价。从急性毒性角度来看，普洱茶的急性毒性小于烘青绿茶，普洱茶的饮用安全性是很高的，但科学的饮茶法是饮茶健身的必然要求；从遗传毒性角度来看，普洱茶和烘青绿茶对原核细胞、真核细胞、生殖细胞都没有致突变性，正规厂家生产的普洱茶是安全的。有关氟含量问题。茶叶中的氟化物含量因产区，品种，加工方式等的不同而具有很大的差异；普洱茶中的水溶性氟含量为77 mgkg，一个成年人每天饮用30克普洱茶并不会引起氟中毒，并没有超过成年人每天最大的氟允许摄取量4.0mg；反而，在亚热带地区的低氟区和适氟区，就氟化物含量而言，普洱茶不失为一种安全有效的防龋用茶品种，因为普洱茶中茶多酚含量偏低，防龋作用不大一。饮用方面，一直有普洱茶“越陈越香”的说法，但现在很多专家提出，从普洱茶的功能品质来讲，并不是越长越好，应有一个最佳饮用期限，但这个最佳的时期还未被研究确定。2.2 普洱茶的生物活性普洱茶的降血糖血脂功效是当今的研究热点问题。国内外学者做了大量的前期研究工作，从临床和实验的角度初步证明了普洱茶确实具有降血糖血脂功效。早期的研究表明普洱茶能明显的降低小鼠血浆中的胆固醇酯含量，也有一定的降胆固醇效果。近期不少研究已经证实普洱茶能有效的降低小鼠血浆中的甘油三酯（TG）以及体内总胆固醇（TC ）的含量水平，可以在增加HDLC的含量水平的同时，降低LDLC的含量水平，从而有效抑制小鼠血脂的升高，起到降血脂的作用效果；而且普洱茶效果优于其他茶类以及晒青毛茶。张冬英等利用高通量筛选法研究发现，普洱茶乙醇提物有潜在的降血糖和降血脂作用的可能性，有必要对其有效部位进行进一步分离纯化，最终从普洱茶中找到高活性的天然降血糖血脂作用因子普洱茶提取物有很大的潜力作为NO消除剂以及抗氧化剂。Iris F.F. Benzie等研究指出，各种茶类在体外表现出的抗氧化活性差异很明显，茶叶的抗氧化活性与茶叶中的酚性成分总量有很强的相关性（r0.956）。普洱茶的发酵过程中多酚总量显著降低，体外抗氧化活性相对较弱，但近年的研究表明，普洱茶的提取物（水提取物，醇提取物，乙酸乙酯提取物等）表现出了很强的生物活性。普洱茶能有效抑制RAW264.7巨噬细胞中由脂多糖（LBP）诱导的NO产生，而且效果优于红茶、绿茶和乌龙茶提取物；另一方而，普洱茶的水提取物也表现出了明显的抗氧化活性，能有效抑制脂制体和非脂制体的氧化损伤。普洱茶乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物对DPPH和羟基自由基都有较强的清除能力；其中乙酸乙酯萃取物的第8组分，它比典型的绿茶儿茶素EGCG的抗氧化活性还要强，但是在这个组分的分析中却没有发现简单儿茶素、茶黄素以及没食子酸等成分；此外，乙酸乙酯萃取物的第2和第8组分以及正丁醇萃取物的第2，4，5组分表现出了对过氧化氢在HPF1细胞中诱导的损伤具有保护作用，还可以在正常条件下增加细胞活性。普洱茶提取物只有抗基因毒性。抗病毒以及抗菌活性。普洱茶提取物能有效的抑制内硝基芳烃引起的基因毒性，能够保护质粒DNA免受Fenton反应引起的损伤；普洱茶提取物比绿茶、红茶和乌龙茶的提取物更能有效的抑制SARS病毒的3CL蛋白酶的活性，只有比较强的抗SARS病毒作用；此外，普洱茶提取物还有一定的抗突变作用，对革兰氏阳性葡萄状球菌和杆状菌有潜在的抗菌活性。3普洱茶生物活性的物质基础和可能的相关机理31 普洱茶中的化学成分作为酶的组分以及酶活性的抑制剂或者激活剂影响体代谢他订类药物对HMGCoA的竞争性抑制作用洛伐他汀（lovastatin）对胆固醇合成中的限速酶HMGCoA（3羟基3甲基戊二酸单酰辅酶A）还原酶有竞争性抑制作用，从而使人体胆固醇合成的速度降低，可以调节胆固醇，降血脂和促进心血管健康。普洱茶提取物抑制SARS病毒的3CL蛋白酶活性ChiaNan Chen 的研究结果表明，普洱茶和红茶的提取物比绿茶和乌龙茶的提取物更能有效的抑制SARS病毒的3CL蛋白酶的活性。普洱茶中的微量元素影响酶的活性。普洱茶中的铬，锰，硒，锌与肌体的糖、脂肪以及胆固醇等代谢紧密相关。铬与糖类和脂类代谢有密切联系，能增加人体内胆固醇的分解和排泄，能辅助胰岛素利用葡萄糖；锰是精氨酸酶以及超氧化物歧化酶等的组成成分，还能激活糖基转移酶的活性；硒作为谷胱甘肽过氧化酶的成分，使脂肪酸按正常氧化渠道氧化下去；锌酶参与了肌体内包括碳水化合物、脂质以及蛋白质的合成和降解一系列的代谢过程，被认为是超氧化物歧化酶的辅助因子。普洱茶对过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）的激活作用氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）具有改善脂代谢的作用；其中亚型之一的PPAR 与脂肪酸氧化有关，能减少血液中的脂肪酸含量；而普洱茶醇提物基本上认为对PPAR 受体有激活作用，有潜在的降血糖血脂作用的可能。3.2 普洱茶中化合物的生物活性黄酮类化合物是很强的抗氧化剂，同时，普洱茶中有黄酮以及黄酮配糖体等黄酮类化合物的存在，它们具有维生素P样的作用，可防止人体血管的硬化，维持毛细血管的正常通透性，能够防治心脑血管疾病；以往的研究也早已证实了茶叶中的咖啡碱、表儿茶素以及黄酮都具有生物活性（没食子酸的作用在后文讨论）。茶叶提取物中的酚性化合物可以和金属离子结合成联合体，普洱茶和其他茶类的提取物有显著的螯合铁离子的能力；Pannala等研究指出，茶提取物对过度态金属离子的螯合作用能够抑制金属离子介导的自由基产物的生成。可见，普洱茶具有显著的螯合铁离子的能力，可以有效抑制铁离子通过Fenton反应引起脂质过氧化。3.3 普洱茶中未知的化合物可能起着关键的作用。高分子量的聚合化合物以及其他儿茶素衍生物。普洱茶比其他茶类有更强的降血脂效果，可能在普洱茶的发酵过程中产生了一些未被确认的新的多酚化合物，可以充当甚至超越儿茶素的角色的由儿茶素衍生而来的高分子量化合物，这些化合物在体内清除活性氧的能力甚至比EGCG强；令人鼓舞的是，在我们的研究中已经发现E8组分清除活性氧自由基的能力比EGCG强。儿茶素类化合物形成的某些氧化聚合产物比儿茶素单体具有更优异的生物活性，例如茶黄素单酯和茶黄素双酯对脂肪氧合酶的抑制作用明显的强于EGCG等儿茶素。儿茶素轻度的氧化聚合可能提高其抗氧化能力，并且儿茶素的抗氧化活性随着聚合度而递增，对自由基的清除能力随单体二聚体三聚体四聚体而递增，还发现五、六聚体具有最强的抗氧化活性。此外，这些高分子量的化合物也可能也具有引起细胞凋亡的活性。普洱茶中的特殊成分红茶中的茶黄素和绿茶中的儿茶素都是有效的抗氧化剂；普洱茶不像红茶富含茶黄素以及绿茶富含儿茶素，却同样表现出了很强的羟基自由基消除能力以及抑制NO合成作用，可能普洱茶中存在某种化合物是很强的NO抑制剂，而这种化合物不存在于绿茶和红茶中。儿茶素类化合物并非是抑制由硝基芳烃诱导的诱变主要成分；尽管红茶和普洱茶多酚含量不高，但是都能有效的抑制内硝基芳烃引起的基因毒性。正如绿茶的非酚性成分脱镁叶绿素a和b对某些基因的表达有很强的抑制作用一般，推测普洱茶中可能存在某些未知的具有很强的生物活性非多酚性成分。4问题和展望41 普洱茶植物化学研究上的困难天然酚类化合物因其分子中含有较多的酚性羟基，件质活泼，不稳定，容易氧化，形成极性更大，聚合度更高的复杂多聚体，与其他天然产物相比，分离鉴定均有很大的困难。这类结构十分复杂的产物在普洱茶的渥堆过程中大量增加，可能是普洱茶生物活性的基础物质，很可能是高活性的天然降血糖血脂作用因子，但它们的结构和组成鲜为人知。这些复杂化合物的分高纯化以及结构鉴定工作是普洱茶化学研究不可回避的难点。目前从事普洱茶植物化学研究的单位和个人相对较少，中国科学院昆明植物所杨崇仁教授和他所领导的科研组成员对普洱茶化学等方面的研究做出了卓越的贡献。42 微生物参与的后发酵过程的复杂性微生物与普洱茶品质的形成休戚相关。在微生物的参与下，晒青毛茶的化学成分在高温高湿环境中发生了剧烈的改变。发酵过程中，微生物利用晒青毛茶丰富的内含物质，进行生长繁殖，产生了一系列的复杂的中间代谢产物，这些中间代谢产物应该具有研究价值；同时，晒青毛茶丰富的内含物质，在微生物本身存在的胞内酶或者分泌的胞外酶的作用下发生一系列复杂的化学变化。近期有研究表明，有些曲霉菌能有效的降解水解单宁，促进没食子酸的生成。微生物参与后发酵的作用机理仍需要进一步的深入研究。43 普洱茶中的可能生理活性成分从目前的研究来看，我们认为存在于普洱茶中的可能的生理活性成分是没食子酸、儿茶素的某种衍生物或者是儿茶素的复杂聚合物等，也可能是几种成分的协同作用。没食子酸在云南普洱茶中的含量比较高，又具有显著的抗氧化活性，以及抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗突变等生理活性，是普洱茶的一个特征性、具生理活性的简单酚类化合物。我们认为，在普洱茶中也可能存在一些没食子酸的衍生物，这些衍生物也具有比较强的生物活性。没食子酸及其衍生物可能是普洱茶中的主要生理活性成分之一，还需要进一步的研究和证实。在我们的研究中已经发现E8组分清除活性氧自由基的能力甚至比EGCG强，初步的纯化研究己经发现E8组分有两个主要的化合物进一步的分离纯化以及结构鉴定工作正在进行中。4.4 展望经现代医学临床验证，普洱茶对人体确有保健作用。随着人们膳食结构的改变，高脂高蛋白类食物量的增加，普洱茶被誉为“减肥茶”、“窈窕茶”、“美容茶”及“益寿茶”等，受到越来越多人的青睐。随着植物化学研究水平以及现代分析检测水平的不断提高，普洱茶的生理活性作用因子会被逐渐的揭示，普洱茶中高活性的降血糖血脂成分会更有效被人们利用。