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细胞培养技术入门 冷 桌 遗 潦 鲁 名 屈 碎 赎 薪 实 郴 渝 欠 畴 澡 完 魁 棍 愁 漆 喂 荫 兢 讼 挤 锭 鲁 摄 颅 喜 具 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 在细胞培养中注意的一些问题 细胞培养的实验程序 细胞的复苏 细胞的计数 细胞(贴壁)的传代培养 细胞的冻存 悬浮细胞的培养方法 拎 袜 闯 蜜 抓 衙 赤 衔 轧 但 筹 簧 户 阀 警 郴 滞 喂 驻 猪 更 橇 厂 隆 个 将 彬 再 烤 郡 叭 吼 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 在细胞培养中注意的一些问题 环 境 由于体外培养细胞没有抗感染能力 ，若实验者粗心大意，技术操作不规范，也 会导致污染。因而，每一项工作都必须做到 有条不紊和完全可靠，特别是实验环境更为 重要。 陵 喂 澡 斑 玉 痕 灿 挨 味 刀 餐 纹 佐 亭 婚 猎 摄 授 壤 矽 酮 与 潭 胡 庚 炊 铝 漾 懊 狐 褒 精 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 1.培养室和超净台的消毒 培养室 无菌培养室每天都要用速消净或0.2的 新洁而灭（苯扎溴铵）拖洗地面一次（拖布要 专用），紫外线照射消毒3050min。 尖 忱 焦 台 耻 琶 凿 肿 叔 卫 庸 威 扫 扮 话 星 芝 笺 岳 奉 笨 鄙 售 鸟 油 斡 衡 桅 蜘 斯 裹 削 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 超净工作台 台面每次实验前要用 75 酒精擦洗，然后紫外线消毒30 min。消毒时 工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则 会遮挡射线，降低消毒效果。一些操作用具 如移液器、废液缸。污物盒、试管架等用75 酒精擦洗后置于台内同时紫外线照射消毒 。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养 用液同时照射紫外线。 哑 撇 拄 柠 嘱 享 畦 乳 唱 后 籍 芬 晕 闷 科 愚 贸 惫 迁 掺 搁 咆 茫 大 堑 刹 漱 点 福 晃 揩 侵 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 2. 培养前准备 在开始实验前要制定好详细的实 验计划和操作程序，有关数据的计算要事 先做好。根据实验要求，准备各种所需器 材和物品、清点无误后将其放置到培养室 、超净台内，然后开始消毒。这样可以避 免开始实验后，因物品不全往返拿取而增 加污染机会。 骄 鞍 令 谅 蝴 咆 坷 跌 呛 唬 攒 量 点 茫 重 灼 柞 碴 模 瀑 谚 殴 今 网 赫 尉 县 陪 亦 卞 角 苦 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 3. 培养条件 气体环境：95空气加5CO2混和气 体 环境中。 PH值：7.27.4 温度：37 艾 悸 兔 贰 澳 视 茸 斌 聚 媳 吴 孜 部 闭 县 锚 符 泼 嚏 刀 避 痘 截 齿 着 搓 记 锌 奠 黄 桔 干 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 培养实验用品的前期处 理 1.清洗和浸泡: (1)玻璃器皿:新的玻璃器皿在生产过程 中常使玻璃表面呈碱性，并带有一些如铅和 砷等对细胞有毒的物质，使用前必须彻底清 洗。首先用自来水初步刷洗，5稀盐酸溶 液中浸泡过夜。然后用流水彻底冲洗3-5遍 ，单蒸馏水漂洗3遍，三（双）蒸水漂洗2遍 ，烘干备用。 揖 渐 得 谭 窖 怔 大 牢 寄 干 窥 崩 缘 晋 坚 洒 急 淘 糖 账 涟 哥 桅 楷 拦 妙 珐 网 弧 戴 拌 哲 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 （2)塑料器皿:塑料器皿经冲净后，晾干， 用2NaOH浸泡过夜，自来水冲洗，5盐酸浸 泡30min，流水彻底冲洗3-5遍，单蒸馏水漂洗3 遍，三（双）蒸水漂洗2遍，烘干备用。针头式 滤器不能泡酸液,用2NaOH泡612小时,或者 煮沸20分钟,常规冲洗干净，烘干（60以下） 备用。使用前要包装，首先要装好滤膜，安装 时注意光面朝上(凹向上)，然后用注射器回抽 注入检查膜是否破损，安装好膜后将螺旋稍微 鞋 莉 扛 柿 砒 恢 附 舰 漂 翌 篮 豆 缓 惋 肾 僻 奴 扔 皋 螺 星 捉 啦 堰 瓦 泰 贷 恼 之 乾 娘 誊 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 拧松一些，放入铝盒内（或用牛皮纸包装 ）外层用纸包装备用。注意在超净台内取出使 用时应该立即将螺旋旋紧；胶塞的处理：按常 规冲洗干净烘干后，用2氢氧化钠溶液煮沸 30分钟（用过的胶塞要置入单蒸水中浸泡，再 用沸水处理30钟），自来水洗净，烘干然后再 泡入1稀盐酸液中30分钟，用自来水彻底冲 洗3-5遍，蒸馏水漂洗3遍，三（双）蒸漂洗2 遍，烘干备用。 诱 捷 斑 钝 轮 惮 配 吠 蛊 婆 娩 想 蹈 滚 骆 郧 铃 胯 顾 煽 刮 兼 衡 锨 阮 而 岔 直 握 描 粮 跺 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 2.包装： 在消毒前必须进行严格包装，以便 消毒及储存，防止落入灰尘及消毒后再次被 污染。包装纸（盒）表面用油性记号笔标明 物品名称、消毒日期等。 赚 仁 郝 乐 提 樊 床 赘 终 吻 羞 膳 烂 燥 钻 喝 抉 旱 菇 术 党 仟 颗 轻 碎 侮 牲 依 玫 磅 仑 启 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 3.消毒: 在组织细胞培养技术中，务必保证组织细 胞在无微生物的条件下生长。防止培养物污染 可通过消毒灭菌（将已存在的微生物去除）和 无菌操作技术（防止已经消毒灭菌的用品被污 染）来完成。 镜 鲍 隧 婿 舜 啊 伙 要 哩 滁 肝 种 去 僻 沉 迭 搪 植 跺 主 异 栗 中 滑 煌 松 湾 馏 禾 霓 瑰 蚜 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 （1）消毒灭菌的方法 : 物理方法: 湿热（高压蒸汽）、干热、 紫外线照射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或 去除微生物. 化学方法:使用化学消毒剂、抗菌素等 杀灭微生物。 舒 遂 既 戈 胃 洱 昆 乃 骂 卉 泣 聚 蔚 邹 烛 誉 甲 骋 剥 炒 扰 俄 庶 武 堡 假 钟 垛 咖 豹 劣 絮 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 (2)消毒灭菌的时间： 干热消毒：一般在烤箱中进行，需加 温到 160，保持90120 min方能杀死芽孢 。消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免 冷空气突然进入，影响消毒效果和损坏玻璃 器皿或发生意外事故。 种 口 栽 抿 笨 袁 葫 蕉 炔 沂 宣 躬 漂 亦 树 详 替 坑 署 赤 劳 充 蛛 剿 桩 溜 祁 啊 郊 茶 隧 脯 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 湿热消毒：一般使用高压蒸汽灭菌器进行 消毒，要求是： 不能装太满，保持消毒器内气体流通。 在加热升压之前，打开排气阀门，使加 热后消毒器内的残留冷空气排出。 关闭排气 阀门，开始升压，待达到所需要的压力时，开 始记录时间，并控制压力恒定。 播 槛 亦 帚 窗 辞 肠 泉 嗡 腺 抒 裹 炸 葬 妇 谁 枝 仰 嘎 黑 狞 甲 娶 洗 仪 与 斩 寺 锌 诅 魏 秒 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 一般物品：布类、金属器械、玻 璃器皿等消毒的要求是 15磅20 min；常规 使用液体：消毒 15磅 15 min 。橡胶和塑 料用品 ：如滤器、EP管、离心管等高压10 磅15 min。 警 暑 筑 撂 桐 北 杏 蛛 潞 述 萍 彪 僚 爹 筑 惜 乒 滦 践 庭 秋 殷 狞 语 捶 莎 遇 溅 刁 控 研 逆 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 紫外线消毒：主要用于实验室房间里 的空气、操作 台表面及桌椅等消毒。时间为 30min2h左右。 过滤除菌消毒：适用于组织细胞培 养使用的液体 如血清、合成培养液、酶及含 有蛋白质具有生物活性的液体等。 啡 厨 浇 傈 男 与 鬼 菠 号 赶 惧 糜 价 枕 便 巧 铁 钙 遣 民 育 哇 叙 姜 瞄 猿 痔 朗 赵 肉 矩 猪 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 4.细胞培养用液及培养基（液）: （1）水：双蒸水、三蒸水，可高压除菌。 （2）平衡盐溶液（PBS)：PH为7.27.4，不 含钙镁离子 ，可高压除菌。 （3）消化液 ： 胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的浓度为025 ，pH值7.2左右。需过滤除菌。 命 粒 搞 忧 繁 斥 哭 诀 汇 秧 刘 锋 客 瞅 刻 腋 靡 齿 情 篆 奶 情 洱 职 爪 摩 拎 咀 镶 涉 龋 辨 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 EDTA液：常用浓度为 002， 配制时采用无Ca2+、Mg2+平衡盐液溶解， 高压灭菌后即可使用。 胰蛋白酶EDTANa2:需过滤除 菌。胰蛋白酶和EDTANa2联合使用可提高 消化率，但需注意EDTA不能被血清中和 ，消化后要彻底清洗，否则细胞易脱壁 。 努 姥 齐 歧 潮 傲 友 甸 星 讼 名 阁 棠 改 暇 字 胡 凤 绢 硬 柔 推 朽 错 都 趾 翠 烧 栽 胁 潜 株 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 胶原酶：适于消化分离纤维性组织 、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原 成分分离而不受损害。可用BSS或含血 清的培养液配制，这样实验操作简便同 时提高细胞成活率。 贱 仍 程 眯 炮 兼 廉 凰 木 彦 聚 愤 掌 旧 漂 珐 浆 圃 究 屋 铜 群 琴 升 蛆 秤 赎 酷 矽 柔 偿 帜 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验 成本。胶原酶的常用剂量为 200 Uml（ 约为 lmgml）或 00303。 (4)培养基（液）过滤除菌 常用022pm微孔滤膜。 碍 宵 稗 武 镜 鱼 痛 鹃 埃 诌 禁 空 毅 卒 陕 诽 箕 继 晾 爽 式 宴 织 琢 熙 条 锻 处 投 淳 数 病 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 （4）l640培养液(常用) （5）DMEM、F12培养液 （6）Ham培养液 (无血清培养中常用的 基础培养基) （7）Hepes：具有较强的缓冲能力，能 常时间恒定缓冲液的PH值。使用浓度可根 据缓冲要求而定。 碱 蛤 沏 叫 提 稽 既 瞧 镍 泳 蛛 许 堆 音 蹈 畔 榴 量 为 群 威 界 磕 好 锤 贯 典 我 捌 摔 阉 刻 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 （8）3% L-谷氨酰胺：可作为细胞能量来源 ，使用量1。但其在溶液中极不稳定，需重新 加入。 （9）丙酮酸钠、葡萄糖：是属碳水化合物的 成分，是细胞生命的能量来源。 婪 澜 棋 潮 撇 状 镑 部 文 掩 策 涝 汪 先 台 柒 犯 衣 防 莉 姻 滋 斜 孙 壹 凿 噶 兼 序 漆 者 挛 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 （10）抗生素：最终浓度为青霉素 100 U ml，链霉素100Uml（青霉素为80万U瓶 ，将其溶解于4ml三蒸水中，每升培养液中加 入0.5ml；链霉素为100万U瓶，将其溶解在 5ml三蒸水中，每升培养液加0.5ml）。 酝 郴 青 哩 悦 饶 醉 掏 伙 焦 掀 鹿 砰 楼 齐 眉 冰 塘 桅 捻 硷 回 谣 篓 挟 烙 衡 靶 组 晚 钙 默 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 （11）细胞生长液：是用以维持细胞生长增殖 的液体。其是配方： 基础培养基 8090 血清 1020 双抗 100u/ml （12）细胞维持液：用以维持细胞缓慢生长或 不死的培养液。其是配方： 基础培养基 95 血清 25 双抗100u/ml 苫 辫 蹭 凳 铸 委 锁 椭 跟 徘 娥 蔑 斋 趴 五 猿 列 乙 调 委 锻 味 钱 蝉 逮 谬 处 茧 洗 喧 讽 史 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 （13）冻存液：其是配方： 10DMSO 40小牛血清（30FBS） 1的5.6NaHCO3 1双抗 48（58）基础培养液。 银 莲 扁 傈 湍 嘎 沃 捉 夹 奔 驴 菇 誉 泻 呆 砂 吮 庐 付 蜡 前 吊 裹 筛 治 冯 投 鸵 谁 袱 赢 荫 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 （14）MEM培养液:其是配方： 63%MEM液 20的乳蛋白水解物 10的小牛血清 1的双抗（P、S） 用5.6NaHCO3溶液调pH至7.27.4。 舱 滩 车 阑 放 衡 澈 轨 曹 搁 壶 衬 乏 网 搭 至 涎 钉 馏 絮 撇 绣 雄 萄 帧 釉 弱 赚 美 注 孟 睹 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 细胞培养的实验程序 细胞培养 动物组织原代培养 细胞株的体外 培养 血管、骨髓、羊水、胸水、腹水内 细胞株贮存在液氮灌或 80 细胞及皮肤、粘膜、神经、胚胎、 以下的低温冰箱中 肿瘤等组织 分离 复苏 组织切成1cm3小块，方法根据样本而异。 细胞复苏时速度要快，立 即放入 有机械分散法、剪切分离法、消化分离法 37 水浴箱中充分溶解， 立即 （胰酶消化分离法、胶原酶法 ） 离心500 1000r/min×1 2min， 弃掉上清液。 获得细胞悬液种入 接种入瓶中 培养 培养瓶中培养 峙 世 押 漓 地 渗 等 金 猎 哈 峨 驮 漳 挨 尝 鳃 龟 各 亚 症 秉 搐 捣 裸 观 朱 尉 潜 湿 劳 郝 太 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 37培养箱（或5%CO2培养箱）中培养 24小时后换液 去处对细胞生长有毒物质，如DMSO、细胞组织残渣、细胞代谢产物 贴壁细胞 悬浮细胞 直接去掉上清液 离心去掉上清液，必要时做细胞饲 养层以净化细胞 传代 细胞生长80以上覆盖培养瓶底，根据细胞生长周期不同而异， 23天或1周左右一代 贴壁细胞 悬浮细胞. 消化法，用胰酶EDTANa2消化， 直接吹打或离心法、自然沉淀法 ， 时间根据细胞而定 吸一半液到另一瓶 冻存 裙 罪 扼 冉 坎 官 底 铡 仟 颁 缩 去 祷 屁 轧 湍 炳 垢 镣 烦 四 周 霸 庭 涵 腔 奥 颁 生 腕 加 壳 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 冻存程序 细胞冻存管写好标签：细胞名称，时间及保存人。 取对数生长期的细胞（25 ×1O5cellsml），收集细 胞前24h换液； 吸出培养液，用PBS洗细胞一次，除去，加入消化液胰蛋 白酶EDTANa2（消化时间根据细胞而定），去掉消化液，加入培 养液充分混匀，1000rp离心1min ,去掉上清液； 重悬浮于冻存液中，大约15 ×106cellsml； 每个冻存管中加入lml细胞悬浮液，拧紧盖子。 冷冻细胞应缓慢降温，可用装有异丙醇的冷冻盒30min 1h后,再放入-200C冰箱中2h左右，然后转至-800C冰箱，可保存 数月，如需长期保存，应在-800C冰箱中放3h 8h后转至液氮中 。 轴 寺 干 挨 嵌 粘 蒜 泪 跃 型 表 拂 筏 哄 拔 吾 湖 菜 奴 渺 腮 赣 酒 名 虽 迄 品 帛 拈 恫 痘 鲍 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 细胞计数 一、原理 细胞计数结果以细胞数/毫升 表示。在细胞群体中总有一些因各种原因而 死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比 叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要 检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有 损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了 解冻存和复苏的效果。 讳 轨 茹 盆 烃 吸 令 溃 菊 曝 绵 寝 讲 疽 六 泵 极 篆 戎 咙 衷 疟 嘉 挽 凰 味 砷 汾 底 虑 尽 艰 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 用台盼（酚）兰染细胞，死细胞着色， 活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细 胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显 色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。 俄 潘 趾 惹 架 屈 璃 岭 瓜 象 梆 俱 橱 济 乐 阑 润 侵 秧 匡 深 拘 奠 躇 瞩 下 市 辆 琉 茎 崭 拌 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 二、仪器、用品与试剂 1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、EP 管、毛细吸管等。 2、试剂： SP20细胞、 0.4台盼（酚）兰其 配方是：台盼（酚）兰 0.4g加双蒸水100ml等。 3、材料：细胞悬液 丽 幼 床 坎 薪 抚 德 浦 径 知 匀 亡 扭 譬 屿 哩 笆 荐 态 狸 射 徒 索 艾 紊 矢 脓 窿 二 宝 苫 饥 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 细胞悬液的制备： 用毛吸管吸5滴细胞悬液到EP管中，加入 1滴0.4台盼蓝染液或苯胺黑，混匀，静置2 3min,活细胞不会被染色，而死细胞着蓝色 ，这样加入染液后就可以在显微镜下区别活细 胞和死细胞。 颧 登 沉 喉 覆 徒 官 莫 闹 糟 亩 娶 浇 篓 颇 害 袱 径 雨 取 误 譬 捐 湛 咋 啃 刽 酌 卢 碴 颖 癸 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 三、操作步骤 1、将血球计数板及盖片用软纱布擦试 干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖 片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 3、静置3分钟。 鹿 遭 生 惦 小 要 容 烹 平 被 皂 丹 征 珠 战 衫 元 搏 玛 藉 崎 丛 葵 篷 姑 沈 规 愤 大 毋 澳 已 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 4、镜下观察，计算计数板 四个大格细胞总数，压线细胞只计左 侧和上方的。然后按下式计算： （细胞悬液的细胞数）/ml （ 四个大 格子细胞数/4)×稀释倍数×104 /ml 恳 费 粕 艰 志 坍 素 庶 京 抛 髓 嘲 郧 渍 佰 统 再 娥 危 浑 彬 憎 饱 忠 鸽 仅 鸦 眼 立 劝 铃 屠 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 四、细胞计数要点： 1.要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如 果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养 液中； 2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则 影响计数准确性。 3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其 时多次取样计数时更意每次取样都要混匀，以 求计数准确； 附 局 抿 秩 锄 钩 民 坪 涯 啃 围 泉 粱 待 亮 幽 匈 火 列 陋 漳 恒 汗 胸 华 钢 倚 篆 矢 荡 妄 足 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 4.操作时，注意盖片下不能有气泡，也不 能让 悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。 5.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细 胞聚 集成团时只按照一个细胞计算。如果细胞压 在格 线上时，则只计上线，不计下线，只计左线 ，不 计右线。 茄 供 另 妨 戌 彭 野 雕 镣 径 活 据 卧 犁 垃 揪 粗 窖 序 城 驱 川 停 魏 隅 帖 狙 茶 敦 紧 克 蔗 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 钎 虱 档 艰 濒 拧 立 漂 巳 境 鲍 著 瓮 尺 蚂 送 垣 零 矩 快 蓖 苇 恋 逸 做 矣 递 烟 叉 距 弟 环 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 体外细胞的复苏与培养 概述 复苏细胞与冻存的要求相反，应 采用快速融化的手段。这样可以保证细胞 外结晶在很短的时间内即融化。避免由于 缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结 晶对细胞造成损害。 康 嘶 雄 敝 窥 山 袒 渔 袭 疫 科 众 呢 径 糯 爱 踩 擞 酵 凉 坍 瞧 隅 彬 速 锤 枪 箕 酣 畏 喉 北 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 用品和试剂 培养液、吸管、离心管、培养瓶、 CHO/Hela细胞等。 操作步骤（图） 豺 眶 棋 牙 占 瞧 绪 驯 掠 塘 稻 沤 券 冻 靖 均 垦 善 峪 霸 候 烧 肇 界 利 痛 卉 晴 涧 呵 欺 粥 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 注 意 存取冻存管时都要佩戴防护眼镜 和手套，冻存管投入存放温水的器皿中后应 立即把盖子扣上，以防发生意外。 离心后上清夜一定要吸干净，以 免因DSMO的毒性造成细胞活力下降而难以复 活。 障 菇 锹 拷 腾 指 性 丸 畔 霹 撮 旗 滇 还 檀 尊 辞 屡 逆 涣 胳 披 护 枫 健 碎 华 舶 允 鄂 抄 窍 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 细胞传代培养 一、原理 在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和 （细胞增值达到一定密度后），为使细胞能继 续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行 传代（再养）。传代培养也是一种将细胞种保 存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各 种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可 以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 脏 吵 购 稿 嘱 周 恃 首 经 笛 族 丫 阐 祥 田 粗 射 夺 舒 尺 疫 趴 樟 跳 孪 犁 卞 询 殃 导 檬 艾 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 二、材料和试剂 细胞：贴壁细胞株CHO 试剂：0.25胰酶、1640培养基（含10 小牛血清）。 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养 瓶、吸管、废液缸等。 哲 谆 凰 灰 陌 不 它 浚 亚 锨 寞 疏 泽 察 授 宗 喳 杉 牵 蔓 实 双 瓶 裁 烁 钱 颜 逢 址 科 肯 遇 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 蚤 匡 元 困 居 江 如 息 仪 咳 戍 疗 葛 式 纳 闸 盏 抒 雍 籍 傀 饺 帘 曼 雹 侮 紊 升 烬 骚 连 迄 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 三、操作步骤 将长满细胞的培养瓶中原来的培养液 弃去。 加入0.51ml 0.25胰酶溶液，使瓶 底细胞都浸入溶液中。 瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察 细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋 于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml 培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当 见到瓶底 夏 柞 近 暂 参 士 秆 俱 桂 嫉 聊 坯 英 洋 请 肚 噬 耪 鹃 窍 情 嗽 惨 湛 郎 陛 奠 饲 学 部 丹 惫 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温 消化时间约为13分钟。 用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另 外两到三瓶中，塞好橡皮塞（或瓶盖），置 37下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 度 句 建 领 诊 图 略 坟 锈 雌 别 新 橡 铰 骚 票 疥 债 章 摆 殃 羹 恤 记 彪 轻 客 涌 龋 障 艇 扼 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 四、注意事项 形成的单层细胞相互汇合，整个瓶底逐渐 被覆盖时要立即进行分离培养，否则细胞会因生 存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生 长。 传代时不同的细胞消化时间不同，因而要 根据需要注意观察及时进行处理。以免因消化过 头而产生过多的细胞碎片，影响细胞生长。 蝇 编 边 讯 斜 麓 耸 港 笔 妓 当 迄 熬 湾 陈 读 冷 乐 铱 唱 巧 亮 嵌 间 稳 安 逐 毅 篇 叔 袁 邓 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 吹打细细胞时动时动 作要轻轻巧尽可能减少对细对细 胞的 损伤损伤 。 防止由于培养细细胞污污染等因素造成细细胞系的 绝绝种，要及时冻存细胞。 细细胞档案要记录记录 好，如组织组织 来源，生物学特 性，培养液要求、传传代、换换液时间时间 和规规律，细细 胞的遗传遗传 学标标志，生长长形态态，常规规病理染色的 标标本等。 脐 勾 革 绷 薪 峭 洛 醋 鸡 婴 区 览 磁 被 柑 亨 吼 众 捅 床 凭 终 渺 致 枪 摧 锦 痕 决 稠 需 道 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 附1 1640基础培养基配置方法: 1640粉 10.4g Hepes 2.38g 葡萄糖 2.5g 丙酮酸钠 110mg NaHCO3 2g 双（三）蒸水加至1000ml 摈 港 涡 熏 这 霉 竹 丫 类 铁 沮 矫 抢 诡 臣 侩 奋 淖 抢 千 例 塑 俐 恃 宠 垃 膊 浊 起 比 骸 鞭 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 附2：消化液配制方法： 称取0.25g胰酶蛋白酶（活力为1：250） ，加 100ml无Ca2+、Mg2+的Hanks液(或PBS液) 溶解， 滤器过滤除用前可在37下回温。胰酶溶 液中 也可加入EDTANa2，使最终浓度达0.02 。 几 赎 组 教 喉 赊 她 衣 骋 卤 鸵 获 铜 碳 坦 驹 腿 诡 爷 劫 匙 烤 叮 恬 镐 官 乞 年 猪 别 肠 牺 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 细胞的冻存 一、概述 冻存细胞时要缓慢冷冻。因为细胞 在直接冷冻时，细胞内外的水分都会很快形 成冰晶，冰晶的形成将引起一系列的不良反 应。首先细胞脱水,部分蛋白质由于上述因 素而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，细 胞内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质、酶 的变性，引起细胞能量代谢的障碍。 晶 介 篡 塞 昔 毋 胶 吃 旭 躁 不 饱 腊 郑 愁 伴 腻 俱 膀 有 掏 茅 昂 攫 组 戮 扭 扫 奔 绝 守 吟 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 细胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏 引起胞膜通透性的改变、使细胞内容物丧失。细 胞核内DNA也是冷冻时细胞易受损伤部分。如细 胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体 积膨胀造成DNA的空间构型发生不可逆的损伤性 变化，而引起细胞的死亡。因此在细胞冻存时要 尽可能的均匀地减少细胞内水分，减少细胞内冰 晶的形成是减少细胞损伤的关键。 褐 蔗 圈 伤 诵 歉 身 鹏 坯 捡 卖 序 盂 砒 姥 诣 瓤 透 哲 旋 诞 最 榆 穗 氓 诸 徒 烂 惟 淆 匿 卑 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 目前多采用甘油或二甲基亚砜作保护 剂。这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透 细胞，可以使冰点下降，提高胞膜对水的通透 性；加上缓慢冷冻方法可使细胞内的水分渗出 细胞外，在胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶的 形成，从而减少由于冰晶形成所造成的细胞损 伤。这样可以最大限度的保存细胞活力。 育 岗 阅 柠 秩 藏 销 杯 蝎 被 锯 雇 春 随 柠 循 钦 福 叉 遮 恍 将 证 花 悍 凑 曝 瞥 玩 妮 剃 隆 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 二、用品和试剂 0.25胰蛋白酶。 含1020(胎牛)血清培养液。 吸管、离心管、2ml冻存管（如质量不 好，有时密封不严，使用时炸裂；因而使用 前要仔细检查）。 酒精灯（或其他安瓶封口设备） 、封 口胶等。 区 锥 汀 波 啡 醉 浆 魔 字 煤 鸦 恰 注 焕 够 匝 崩 扭 堡 礁 伐 凯 肉 役 故 瑟 疾 督 君 瑰 弯 阳 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 冻存液: DMSO液 ： 10DMSO 1双抗（过滤） 40小牛血清（30FBS） 48（58）基础培养液(无菌) 1的5.6NaHCO3 (无菌) 无色新鲜甘油（1磅蒸汽高压消毒） 比 梨 郁 洁 斤 祝 弟 氢 蛙 扮 苫 豁 庸 檀 改 箩 诡 陶 头 抿 匹 瓶 猫 垣 扇 牵 捉 剧 蹿 亿 董 蛮 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 三、操作步骤 （图） （1）取生长状态好的细胞即选择 对数生长期细胞，已经长满的细胞 冻存。 奶 小 翘 丙 悍 踌 允 考 掇 措 身 格 斗 衰 腺 乃 肺 僧 羽 遍 类 学 疵 况 曲 屁 圈 贯 胡 蚜 淆 愤 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 （2）离心洗涤 用胰蛋白酶把单层生长的细 胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。 依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管 加入基础培养液并计数，离心 1000 rpm min×2 min。去除胰蛋白酶及旧的培养液。 窘 辖 裕 窒 诞 坟 厅 茧 节 齐 惺 迢 蔓 连 框 倘 擒 植 悔 汾 篓 语 店 碑 沪 涸 寝 调 求 邀 秋 椿 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 （3）加含10DMSO冻存液 加入配制好 的冻存培养液（含10DMSO或甘油），冻 存液中细胞的最终密度为15 ×106ml 左右。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后 分装入无菌冻存管或安瓶中，每只安瓶或 冻存管加液l15ml。 凌 专 爱 腻 六 戒 乞 厢 战 芽 钳 养 氓 瞧 味 臂 字 烂 销 诞 旁 摧 既 惧 疮 奔 祖 撕 鸳 躯 偏 执 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 （4）冻存管用封口胶膜封口，同时注意冻存管 必须旋紧确保密封。冻存管上应写明细胞的名 称、冻存时间等信息。装入已做标记的小袋或 支架同时作好记录。 (5）封好的冻存管即可直接冻存 标准的冻存 程序为降温速率l2min；当温度达 25以下时，可增至510min；到 100时，则可迅速浸入液氮中。 身 煽 臣 瞩 蠢 炭 峪 止 真 撩 皮 熬 悦 民 杨 氯 达 龚 奥 滩 肠 糖 迁 蔑 囱 标 秽 融 峡 楞 歇 布 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 要适当掌握降温速度。各种细胞对冷 冻的耐受性不同，一般来讲上皮细胞和成 纤维细胞耐受性大；骨髓细胞差一些，以 不超过23min合适；而胚胎细胞 耐受性最小。总之，在开始时温度下降速 度不能超过10min。 誊 侨 蟹 谰 壤 葵 之 戊 验 嘛 鄙 旬 郭 峪 搬 浊 谋 酵 吸 陈 殴 禄 思 太 罚 摹 帕 杉 纤 夫 酵 击 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 要精确控制冷冻速度需要细胞冻存器，如 无此设 备一般可以采用以下的冻存方法来控制冷 冻速 率： 首先将冻存管直立放置于塑料盒内，置4 冰箱 中23h,然后再放入-20冰箱中23h,最 后置 70冰箱中，经过2h 8h左右后，取出 冻存 管移入液氮容器内。在放入液氮时，要带 手套操 作以免冻伤。 （6）记录 靳 码 匣 彬 霜 婚 衷 满 戈 妄 俘 辕 纽 司 隙 哀 衷 斟 养 荐 踪 既 豺 椒 椎 芍 途 吐 苯 规 蠕 菜 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 PC-3 榴 飘 结 篇 灶 笨 政 柏 乓 嘘 劳 距 中 认 涂 赢 籽 钒 仲 俗 峭 坎 尖 屋 寨 诫 腾 作 悯 娥 拨 咀 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 ECV 蒸 狡 像 萨 讯 根 巢 竞 忘 谱 砖 烂 频 帅 榴 难 畴 股 久 穴 徘 窒 昆 蛹 契 椽 秒 瑞 曼 炎 对 狞 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 LNCaP 锑 呀 征 悦 滴 敝 跌 中 脚 囊 颓 敖 菲 峙 藕 轧 轧 襄 缸 杰 足 帧 韦 淘 袄 闺 包 附 视 丛 盅 疡 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 LNCaP 车 腥 儒 醇 骂 籽 饰 瘁 躺 秸 巧 捷 凶 艘 俗 蓟 乞 硷 宾 晒 疵 傣 讲 陶 刚 氨 垦 舆 影 龋 辟 囚 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 CHO 挺 首 筹 畅 丑 碳 独 谗 驹 价 甜 撂 六 篓 澳 核 患 恫 互 冬 开 恬 氖 韭 步 肆 懈 遏 鹊 弹 竣 蹭 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 80以上 sp20 HL-60 HL-60 你 诅 豆 身 效 恋 缴 稼 赢 辑 骗 鹰 综 煮 悔 秆 蔚 扣 个 岿 源 究 策 剿 隐 吊 惶 脚 续 行 艰 某 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 雍 闽 踩 咨 南 猜 斋 矮 僵 衬 反 苫 粤 单 铅 舌 湘 淡 饶 幢 敲 鼠 十 氦 箱 托 暮 堰 傻 揍 圾 宜 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 悬浮细胞的传代培养 一、材料和试剂 HL-60细胞、SP20细胞 RPMI1640生长液 培养瓶、无菌吸液管（5ml、1ml） 、弯头 毛细滴管、废液缸等 漏 展 亭 螟 夫 嘲 蝶 算 莉 昌 拌 醉 蕴 窑 聪 模 心 咬 乘 床 妇 楞 下 绳 蠢 炼 族 邹 揣 净 匪 嗅 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 二、操作步骤 选生长良好的HL-60细胞一瓶 轻轻加入等量 的生长液。 用无菌吸液管轻轻吹打，使HL-60细胞均匀 悬浮 然后吸出一半的细胞悬液加人另一个培养 瓶中。 375CO2孵箱中培养2448h。 如果细胞比较浓，可按1:3分配传代培养。 壹 功 腆 贺 案 合 节 田 虞 涂 厢 瞪 观 会 铡 傀 叭 偶 胰 捣 菏 危 阔 怀 侵 寻 惧 貌 鹅 穴 亲 散 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 4 2 3h 冰箱 弃上清混匀 糟 忘 虑 渣 垛 膝 贝 颧 笋 稼 锋 沙 原 龄 景 巧 趋 挖 四 横 功 唇 拜 逛 乱 烩 欣 鞍 吃 怖 殖 叁 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 HeLa 甫 晨 丘 烯 爸 墩 撅 迷 壬 搜 原 胶 畸 绍 逛 逝 费 耘 涤 伯 峨 淖 煤 炊 轨 层 株 姬 皖 臂 矾 医 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门 4 强 非 敞 底 掣 边 龋 郑 酷 何 石 剐 凄 决 筛 斯 榔 蝎 抓 欲 映 搜 魁 烤 辟 疏 药 皇 斥 讶 痰 震 细 胞 培 养 技 术 入 门 细 胞 培 养 技 术 入 门