222动物细胞融合和单克隆抗体-精选文档.ppt

一、动物细胞融合（细胞杂交）,将两个或多个细胞结合形成一个细胞的过程。 融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。 诱导动物细胞融合的方法：聚乙二醇、灭火的病毒（仙台病毒）、电激 意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交称为可能。,用灭活病毒诱导动物细胞融合过程的示意图,二、单克隆抗体,（单个细胞增殖而形成的细胞克隆只产生完全均一的单一特异性抗体） 化学性质单一、特异性强的抗体 每个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 1975年，英国 米尔斯坦 和 德国 柯勒,骨髓瘤细胞,免疫小鼠,杂交细胞,PEG 灭活的仙台病毒,选择性培养基 杂交瘤细胞增殖 未融合细胞死亡,1.单克隆抗体的制备,将不同种杂交细胞分开，并克隆专一抗体，检测阳性细胞,选择性培养基 杂交瘤细胞增殖 未融合细胞死亡,PEG 灭活的仙台病毒,筛选产生特异抗体的细胞群,如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？,融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。 但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行34次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。,体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低 体内实体瘤法 对数生长期的杂交瘤细胞接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml, 共24点。待肿瘤达到一定大小后(一般1020天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mgml。但采血量有限。 体内腹水的制备 腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞710天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获110ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml， 这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。,腹水（ascites）,腹腔中的渗与液（含有炎症细胞）。在实验性动物腹腔中生长的骨髓瘤或杂交瘤可形成腹水，腹水中含有高水平的骨髓瘤蛋白或特异性抗体。临床上腹水由肿瘤种植于腹膜、门静脉梗阻（如肝硬化）或低蛋白血症（如营养不良）所致。,2.单克隆抗体的应用,优点：特异性强、灵敏度高，并可能大量制备 应用： 作为诊断试剂（准确识别抗原） 用于治疗疾病和运载药物 生物导弹,生物导弹,追踪肿瘤而又能专一性地杀伤肿瘤的“武器” 弹体（通常为单克隆抗体）和弹头（通常为抗癌药或毒素等）组合而成。 进入人体后，“生物导弹”在抗体指引下能自动搜索到肿瘤所在部位，然后用弹头击中癌细胞。,新的“生物导弹”,单克隆抗体免疫毒素 原理是以结肠、胃、肺与胰腺等组织的癌细胞表面的碳水化合协“表位”（抗原决定簇）为目标，开发出针对这一表位的专用抗体，然后再与天然毒素“美登素”结合而成为新型抗癌“生物导弹”。体外试验证实：即使肿瘤细胞表面的抗原数量极少（仅20%或30%），新型“生物导弹”仍能精确击中癌细胞，而不会伤害正常细胞。,