2018年ld02-细胞中心法则与基因工程技术原理-文档资料.ppt

生命最重要的本质之一是性状特征自上代传至下代遗传。,1,关于遗传，是大家经常讨论的一个话题 孩子会与父母有许多相似之处，如性格、身材高矮、体形胖瘦、肤色深浅、眼睛大小、鼻子高低很多很多都与父母的遗传有关 还有很多疾病的发生也与父母的遗传密切相关。,2,中心法则,遗传信息,信使,性状,中心法则的发展与补充,1.遗传信息从RNA流向RNA，即RNA的复制 2. 遗产信息从RNA流向DNA，即逆转录 （常见于病毒的增殖）,复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。 转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。 翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。 逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。,DNA的结构,四种脱氧核苷三磷酸ATCG （dATP、dGTP、dCTP、dTTP) 2. A=T，C三G 两两配对 3. 每条链由5端向3端延伸 4.两条链反向平行成双螺旋结构,与DNA复制有关的酶和蛋白质 原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP) 模板：以DNA的两条链为模板链，合成子代DNA。 酶：DNA聚合酶，DNA连接酶，拓扑异构酶等 能量：ATP 引物：一小段RNA(或DNA）为引物,DNA的复制 观看视频1 观看视频2,总结： 目的细胞生长、增殖，遗传信息 特点半保留复制（保证遗传的稳定性）；一条链连续复制、另一条链不连续（与DNA合成方向5-3有关）,端粒与寿命,细胞生长、增殖端粒是真核生物染色体线性DNA分子末端的结构，像两顶帽子那样盖在染色体两端，因而得名。端粒在维持染色体和DNA复制的完整性方面有重要作用。随着细胞分裂DNA复制次数的增加，端粒的长度是在逐渐缩短的，当端粒变得不能再短时，细胞不再分裂而死亡。,Cell：早期端粒酶失活将加速衰老 JCI CHEST J：端粒突变更易患肺部疾病 The FASEB Journal：逆转生命时钟，延长细胞端粒 Genes Devel：科学家发现控制细胞衰老的开关端粒酶 PLoS One：揭示焦虑症、过早衰老与染色体端粒的缩短直接相关 PNAS：个体的端粒长度可能预测寿命长短,端粒与寿命,观看视频：端粒与寿命,可见，端粒的缩短限制了人类的生命跨度，但另一方面也能限制癌症的发生，所幸我们还能做点什么，因为端粒缩短的程度也受到你的生活方式与环境的影响。,Nature Genetics：研究发现端粒更长增患脑癌风险 Cancer Epidem Biomarker：端粒长度越短患胰腺癌风险越高 PNAS：家庭贫穷儿童端粒变短 British Journal of Sports Medicine：少坐一会儿，端粒就能变长吗？ Circulation：运动有助于保持白细胞端粒长度 PLOS Genetics：咖啡或啤酒可能会影响端粒长度,定义:以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA称为逆转录，由逆转录酶催化进行。,逆转录合成DNA,逆转录酶是多功能酶： RNA指导的DNA聚合酶活性 DNA指导的DNA聚合酶活性,逆转录酶也和DNA聚合酶一样，沿53方向合成DNA，并要求短链RNA作引物。,cDNA：几乎所有真核生物mRNA分子的3末端都有一段polyA,当加入寡聚dT作为引物时，mRNA就可作为模板，在逆转录酶催化下在体外合成与其互补的DNA，称为cDNA。,逆转录酶发现的理论和实践意义： 不能把“中心法则”绝对化，遗传信息也可以从RNA传递到DNA。促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索。目前逆转录酶已经成为研究这些学科的工具。,1983年，发现人类免疫缺陷病毒（human immune deficience virus,HIV）,感染T淋巴细胞后即杀死细胞，造成宿主机体免疫系统损伤，引起艾滋病（ acquired immunodeficiency syndrome,AIDS）,RNA的生物合成,一、RNA聚合酶 二、RNA的转录过程 三、转录后加工 四、RNA的复制,转录：以DNA的一条链为模板在RNA聚合酶催化下，按照碱基配对原则，合成一条与DNA链的一定区段互补的RNA链的过程称为转录。 以四种核糖核苷三磷酸酸（NTP）为底物，形成3、5 -磷酸二酯键相连接。,二、RNA的生物合成：,一、关于RNA合成过程中的几个概念：,1、模板链（无义链）：指导RNA合成的那条链。 2、编码链（有义链）：与模板链互补的那条链。 3、启动子：DNA分子上结合RNA聚合酶，并形成 转录起始复合物的区域。 4、终止子：促进转录停止的特殊 DNA序列。 可分两类：依赖因子的和不依赖 因子的。,二、真核生物与原核生物基因的区别：,1、真核生物基因内部有内含子是断裂的、不连续的，而原核生物内部则没有。 2、真核生物基因一般是独立的，而原核则一般是由多个基因联合在一起而形成操纵子结构。如：大肠杆菌的乳糖操纵子。,真核生物内含子结构,原核生物操纵子结构,观看视频：乳糖操纵子模型,操纵子Operon : 基因表达的协调单位,它们有共同的控制区和调节系统。包括在功能上彼此有关的结构基因和控制部位.,二、RNA的转录过程,RNA的转录过程：（以大肠杆菌为例） 起始位点的识别 转录起始 链的延伸 转录终止,（1）起始位点的识别,RNA的合成不需要引物。体外实验证明，不含亚基的核心酶会随机地在一个基因的两条链上启动，当有亚基时就会选择正确的起点。 亚基起着识别DNA分子上的起始信号（启动子指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列）的作用。启动子的结构至少由三部分组成：-35序列提供了RNA聚合酶全酶识别的信号；-10序列是酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）；第三部分是RNA合成的起始点。,（2）转录起始,RNA聚合酶全酶扫描解链区，找到起始点，然后结合第一个核苷三磷酸。加入的第一个核苷三磷酸常是GTP或ATP，很少是CTP，不用UTP。所形成的启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物，第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点， 亚基就会被释放脱离核心酶。,因子仅与起始 有关，RNA的合 成一旦开始， 便被释放,（3）RNA链的延伸,DNA分子和酶分子发生构象的变化，核心酶与DNA结合比较松弛，可沿DNA模板移动，并按模板顺序选择下一个核苷酸，将核苷三磷酸加到生长的RNA链的3-OH端，催化形成磷酸二酯键。转录延伸方向从5 3,（4）转录终止,在DNA分子上（基因末端）提供转录停止信号的DNA序列称为终止子（terminators),它能使RNA聚合酶停止合成RNA并释放出RNA。,需要因子（终止因子，协助RNA聚合酶识别终止信号）帮助， 因子能与RNA聚合酶结合但不是酶的组分，它的作用是阻止RNA聚合酶向前移动，于是转录终止，并释放出已转录完成的RNA链。,不依赖于因子。强终止子序列有两个明显的特征：（ 1 ）在终止点之前具有一段富含G-C的回文区域。（2）富含G-C的区域之后是一连串的dA碱基序列，它们转录的RNA链的末端为一连串U（连续6个）。,三、RNA的转录后加工 在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录物（primary transcript）往往需要一系列的变化，包括链的裂解、5和3末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的RNA分子。此过程总称为RNA的成熟或称为RNA的转录后加工。,mRNA前体的加工： 原核生物的mRNA转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。亦有少数多顺反子的mRNA需要核酸酶切成小单位，然后再翻译。 真核生物mRNA（半寿期较长）原初转录物很大，在加工过程中形成许多分子大小不等的中间物，它们被称为核内不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)，需要进一步进行加工修饰转化为mRNA。加工包括： （1）hnRNA被剪接，把内含子（DNA上非编码序列）转录序列剪掉，把外显子（DNA上的编码序列）转录序列拼接上(真核生物一般为不连续基因)。 （2）3端添加polyA “尾巴”； （3）5端连接“帽子”结构（m7G5ppp5NmpNp-）； （4）分子内部的核苷酸甲基化修饰。,观看视频：RNA的合成,总结： 目的释放遗传信息（mRNA）以表达性状与功能 特点受到精细化调控，有时空特异性,蛋白质的生物合成,蛋白质合成体系的重要组成部分 蛋白质的合成过程 蛋白质合成后的运送,蛋白质与氨基酸,六伴穷光蛋：硫、半、光、蛋半胱、胱、蛋（甲硫）氨酸含硫氨基酸 酸谷天出门：酸、谷、天谷氨酸、天冬氨酸酸性氨基酸 死猪肝色脸：丝、组、甘、色丝、组、甘、色氨酸一碳单位来源的氨基酸 只携一两钱：支、缬、异亮、亮缬、异亮、亮氨酸支链氨基酸 一本落色书：异、苯、酪、色、苏异亮、苯丙、酪、色、苏氨酸生糖兼生酮 拣来精读之：碱、赖、精、组赖氨酸、精氨酸、组氨酸碱性氨基酸 芳香老本色：芳香、酪、苯、色酪、苯丙、色氨酸芳香族氨基酸 不抢甘肃来：脯、羟、甘、苏、赖脯、羟脯、甘、苏、赖氨酸不参与转氨基的氨基酸,DNA能够编码20种天然氨基酸，它们几乎是细胞生命中一切氨基酸的合成单体,牛胰岛素蛋白结构,20种结构各异、物理化学性质不同的氨基酸，赋予了蛋白质无限可能的结构与空间构象,mRNA和遗传密码,mRNA由DNA经转录合成，携带着DNA的遗传信息，然后作为模板通过翻译将遗传信息传递给蛋白质，即由它直接决定多肽链中AA的顺序。所以mRNA为模板的蛋白质合成过程被称为翻译或转译。 mRNA分子中四种不同碱基（A、G、C和U）构成特定顺序决定蛋白质分子中20种氨基酸所构成的序列。 大量实验证明mRNA上相邻三个碱基编码一种氨基酸，因而被称为碱基三联体或密码子。 四种核苷酸，能有43 =64组密码子,遗 传 密 码,阅读方向为5-3,遗传密码的特点 密码子的方向性 密码子的阅读方向及它们在mRNA由起始信号到终止信号的排列方向均为5-3，与mRNA链合成时延伸方向相同。 密码子的简并性 64-3=61个代表20种氨基酸，仅甲硫氨酸、色氨酸只有一个密码子。一个氨基酸可以有几个不同的密码子，编码同一个氨基酸的一组密码子称为同义密码子。这种现象称为密码子的简并性。,密码子的连续性（读码）（无标点、无重叠） 从正确起点开始至终止信号，密码子的排列是连续的。既不存在间隔（无标点），也无重叠。在mRNA分子上插入或删去一个碱基，会使该点以后的读码发生错误，称为移码，由这种情况引起的突变称为移码突变。,密码子的基本通用性（近于完全通用） 对于高等、低等生物都适用，只有一个例外：真核生物线粒体DNA。（P397）一些原核生物中利用终止密码翻译AA（UGA-Trp硒代半胱氨酸）,起始密码子和终止密码子 64种密码子中，AUG为甲硫氨酸的密码子，又是肽链合成的起始密码子，UAA，UAG，UGA为终止密码子，不编码任何氨基酸，而成为肽链合成的终止部位（无义密码子）。 密码子的摆动性（变偶性） 如丙氨酸：GCU，GCC，GCA，GCG，只第三位不同 ，显然密码子的专一性基本取决于前两位碱基，第三位碱基有较大灵活性。发现tRNA上的反密码子与mRNA上的密码子配对时，密码子的第一位、第二位碱基配对是严格的，第三位碱基可以有一定变动，这种现象称为密码的摆动性或变偶性（wobble）。IA、U、C配对。,mRNA是蛋白质生物合成的直接模板。 tRNA的作用体现在三个方面：3CCA接受氨基酸；反密码子识别mRNA链上的密码子；连接多肽链和核糖体。,tRNA有两个关键部位： 3端CCA：接受氨基酸，形成氨酰-tRNA。需ATP提供活化氨基酸所需的能量。 与mRNA结合部位反密码子部位（tRNA的接头作用）,tRNA凭借自身的反密码子与mRNA链上的密码子相识别，把所带氨基酸放到肽链的一定位置。,合成场所rRNA及核糖体 核糖体是由几十种蛋白质和几种rRNA组成的亚细胞颗粒,其中蛋白质与rRNA的重量比约为1:2。核糖体是蛋白质合成的场所。,原核和真核生物的核糖体的构成,rRNA序列成为微生物生物学种属鉴定的主要依据,蛋白质肽链的合成步骤,一、氨基酸的活化 二、肽链合成的起始 三、肽链的延伸 四、肽链合成的终止与释放 五、真核细胞蛋白质生物合成 六、肽链合成后加工和折叠,一、氨基酸的活化,氨基酸在掺入肽链前必须活化。氨基酸的活化是指各种参加蛋白质合成的氨基酸与携带它的相应的tRNA结合成氨酰-tRNA的过程。活化反应在氨酰-tRNA合成酶的催化下进行。,氨基酸活化的总反应式是：,氨基酸+ATP+tRNA +H2O 氨酰-tRNA+AMP+PPi,氨酰-tRNA 合成酶,因此，氨基酸的活化是消耗能量ATP与载体tRNA连接的过程。,二、肽链合成的起始 起始密码子的识别：以原核生物大肠杆菌为例 起始密码子AUG上游（5端）约10个核苷酸处有一段富含嘌呤的序列（SD序列、RBS），原核生物核糖体30S小亚基上的16SrRNA3端富含嘧啶的序列能与之互补配对，这样30S亚基能与mRNA结合，识别起始密码子AUG。,在肽链合成起始时，首先是核糖体小亚基与mRNA上的核糖体结合位点识别结合，然后，大亚基与小亚基结合，形成完整的核糖体(70S起始复合物)。,消炎药：链霉素、新霉素、卡那霉素与原核细胞30S核糖体结合，阻止50S核糖体亚基与之结合，从而抑制其蛋白质合成。,蛋白质合成抑制剂,三、肽链的延伸,1、进位 新的氨酰-tRNA进入A位。需要消耗GTP。,2、转肽 在肽酰转移酶的作用下P位点上fMet-tRNAf的甲酰甲硫氨酸从相应的tRNA上解离下来，其-COOH（高能酯键）与刚进入A位的氨酰-tRNA上的-NH2形成肽键，此时A位点携带一个二肽。,P,A,5,3,3、移位 在移位酶的作用下，核糖体沿mRNA5 3方向移动，每次移动一个密码子的距离，结果使原来在A上的肽酰-tRNA移到了P位点，同时一个新的密码子进入空的A位。,P,A,P,P,A,A,以上三步为一个延伸循环，肽链每掺入一个氨基酸就重复一次延伸循环。肽链从N-C合成,四、肽链合成的终止与释放 当终止密码子出现在A位时，终止因子结合在A位，肽链合成终止。,RF1：识别终止密码子UAA和UAG RF2：识别终止密码子UAA和UGA RF3：具GTP酶活性，激活RF1和RF2活性，协助肽链的释放,终止因子的结合使肽酰转移酶活性变为水解酶活性，肽基不转移给A位tRNA，而转移给H2O，并把已合成的多肽链从核糖体和 tRNA上释放出来，无负荷的tRNA随机从核糖体脱落，该核糖体立即离开 mRNA，在IF3存在下,消耗GTP而解离为30S 和50S非功能性亚基。再重复下一轮过程。,蛋白质的合成是一个高耗能过程 AA活化 2个高能磷酸键（ATP） 肽链起始 1个（70S复合物形成，GTP） 进位 1个（GTP） 移位 1个（GTP,第一个氨基酸参入需消耗3个（活化2+起始1 ） 以后每掺入一个AA需要消耗4个（活化2 +进位 1个 +移位1个）。,（三）蛋白质合成后的修饰 蛋白质合成后的几种修饰方式：氨基末端的甲酰甲硫氨酸的切除、肽链的折叠、氨基酸残基的修饰、切去一段肽链。,蛋白质合成的场所是核糖体,原料是20种L-氨基酸，反应所需能量由ATP、GTP提供，此外还有Mg2+、K+ 等金属离子参与。 蛋白质合成体系主要由mRNA、tRNA、rRNA、有关的酶以及几十种蛋白质因子组成。,中心法则的总结 观看视频：DNA 转录与翻译,关于转基因,转基因是指利用基因工程技术将外源（非同种）基因DNA整合进目标物种基因组中，遵照目标物种的中心法则，进而有效表达出相应的产物（多肽或蛋白质），从而定向地改变目标物种的功能与性状。,转基因食品（GMO）引起了世界范围的担忧与争议： 解决粮食短缺生存是第一位 抗病虫害、减少农药使用、避免环境污染 增加食物营养与品质,担忧： 基因漂流影响其他物种，其携带的抗生素标记基因可能导致的物种的抗药性 对生物多样性造成威胁、转基因作物有可能演变为农田杂草,观看视频： GMO的争议,放映结束，感谢观看！,