下游技术第三章细胞破碎3-文档资料.ppt
微生物细胞的破碎,微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，称为胞外产物。(例如细菌产生的碱性蛋白酶，霉菌产生的糖化酶等) 还有许多是存在于细胞内(例如青霉素酰化酶，碱性磷酸酯酶等)称为胞内产物。 对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液， 对于胞内产物，则需首先收集菌体进行细胞破碎，使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的分离。,细胞壁的组成和结构,细胞破碎是为了破坏细胞外围使细胞内含物释放出来。微生物的细胞外围通常包括细胞壁和细胞膜。 细胞膜使细胞内外保持一定的浓度差，它主要由蛋白质和脂质组成，强度比较差，易受渗透压冲击而破碎。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁。,细菌的细胞壁,几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固的骨架肽聚糖组成，是由肽聚糖链借短肽交联而成，使细胞具有一定的形状和强度。 短肽一般由四或五个氨基酸组成，如L丙氮酸D谷氨酸L赖氨酸D丙氨酸。 肽聚糖键是N乙酰葡萄糖胺和N乙酰胞壁酸交替地通过（l4）糖苷键联接而成。短肽接在N乙酰胞壁酸上，相邻的短肽又交叉相联，形成了网状结构。,革兰氏阳性菌的细胞壁,革兰氏阳性菌的细胞壁,细菌的细胞壁,革兰氏阳性菌的细胞壁较厚（1550 nm），肽聚糖占40一90，其余是多糖和磷壁酸， 革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄（1.52.0nm），最外面还有一较厚的外壁层（810 nm），外壁层主要由脂蛋白，脂多糖组成。 破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肤键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,酵母菌的细胞壁,主要成分为葡聚糖与甘露聚糖以及蛋白质等，比革兰氏阳性菌稍厚，而且其厚度随菌龄增加而增加。 细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状 覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白， 再外面是由1，6磷酸二酯键共价连接而成网状结构的甘露聚糖。有甘露聚糖酶的复合物，它可以共价连接到网状结构上，也可以不连接。,真菌的细胞壁,大多数真菌的多糖壁，主要存在三种聚合物，葡聚糖（主要以（13）键连接，某些以（l6）键连接），几丁质（以微纤维状态存在）,糖蛋白。 真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关 它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。 几丁质就是由 N- 乙酰葡萄糖胺分子，以 b -1,4 葡萄糖苷键连接而成的多聚糖。,为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）：,一、细胞壁的组成和结构,细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固； 酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度； 由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。,二、常用破碎方法,进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。,1.珠磨法（Bead mill）,原理：,实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、 Braun匀浆器； 中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。,珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。,采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成，英国APV公司和美国 Microfluidics公司均有产品出售）。,2.高压匀浆法（High-pressure homogenization） 大规模细胞破碎的常用方法,利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。,原理：,在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。,易造成堵塞的团状或丝状真菌， 较小的革兰氏阳性菌， 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）,不宜采用高压匀浆法。,在15-25 kHz的频率下操作。其原理可能与空化现象（cavitation phenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。 空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。,3.超声破碎法（Ultrasonication）,一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差， 该法在实验室小规模细胞破碎中常用。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。,4.酶溶法（Enzymatic Lysis）,（1）外加酶法,常用的溶酶,溶菌酶、 -1，3-葡聚糖酶、 -1，6-葡聚糖酶、 蛋白酶、 甘露糖酶、 糖苷酶、 肽键内切酶、 壳多糖酶等,溶菌酶主要用于细菌类,细胞壁溶解酶是几种酶的复合物,对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。,利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。,酶溶法的优点： 选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。,缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。 在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。,诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。 影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激活剂和细胞代谢途径等。 缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,（2）自溶法（Autolysis）,某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,4.化学渗透法（Chemical permeation）,该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。 其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可使细胞破碎。,（1）表面活性剂,可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。,处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。,（2）EDTA螯合剂,能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。 甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。,（3）有机溶剂,（4）变性剂,盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲（Urea）是常用的变性剂。 变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。,* 表适用,通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒 。,化学渗透法优点：,缺点：,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。 此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。,5.其他方法,1. X-press法,将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。,2. 渗透压法（Osmotic pressure）,将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。 适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。,3. 反复冻结-融化法,使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。 气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30的气流中吹干； 真空干燥多用于细菌。,4.干燥法,三、破碎率的测定与破碎技术的研究方向,细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。,1. 破碎率的测定,直接测定法 目的产物测定法 导电率测定法,采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。 如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色； 采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。,将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。,细胞破碎与固液分离紧密相关。,2.破碎技术的研究方向,多种破碎方法相结合 与上游过程相结合 与下游工程相结合,化学法、酶法、机械法相结合。 如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100%。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32%。,在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如pH、温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。细胞的破碎与上游培养过程有关。 此外，用基因工程的方法对菌种进行改造，以提高胞内物质的提取率也是非常重要的。 在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂（如青霉素、环丝氨酸等），继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎； 选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌； 在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。,
