实验诊断-2016-4-24第八章 临床常用免疫学检测1_20160702010346-文档资料.ppt

,前言： 随着免疫学原理的深入和免疫技术的发展，临床免疫学检测在实验诊断中的比重越来越大。由于其具有高的特异性和敏感性，被广泛应用于感染性疾病、免疫系统疾病、变态反应性疾病和肿瘤的诊断、鉴别诊断和预后，以及移植后免疫监测和治疗等。 本章主要对体液免疫、细胞免疫、肿瘤标志物、自身抗体、感染免疫和移植免疫检测等方面做一简述。,本章内容,体液免疫检测 细胞免疫检测 肿瘤标志物检测 自身抗体检测 感染免疫检测 移植免疫检测 其他免疫检测,第一节 体液免疫检测,体液免疫主要包括抗体和补体系统。抗体属于免疫球蛋白，在不同疾病及感染阶段，免疫球蛋白类型和含量各有不同。免疫球蛋白( immunoglobulin，Ig)是由浆细胞合成分泌的一组具有抗体活性的球蛋白，存在于机体的血液、体液、外分泌液和部分细胞的膜上。 免疫球蛋白因其功能和理化性质不同分为 IgG 、 IgA 、IgM 、IgD和IgE五大类。 Ig的检测都是利用特异性的抗原抗体反应进行的。血清中的IgG、IgM和IgA的含量较高，可采用单向免疫扩散法、免疫透射比浊法、免疫散射比浊法进行测定。IgD、IgE的含量较低，常用ELISA、放射免疫（RIA）、荧光偏振 技术、化学法发光法进行检测。,免疫相关性疾病诊断的常用方法主要有： 单向免疫扩散法 免疫散射比浊法 酶联免疫吸附法 (Enzyme-linked Immunosorbant Assay, ELISA) 放射免疫(RIA) 荧光偏振技术 化学发光法 免疫印迹法 (Western-blot, WB) 芯片法 (gene-chip)等,倾注平板 打孔 加样 放置37 2448h观察沉淀环,单向扩散试验（平板法）,原理 误差主要原因 评价 单向环状免疫扩散法示意图,单向环状免疫扩散法,免疫比浊法测定原理示意图,抗核抗体谱检测方法,蛋白芯片技术检测,样品处理 反应抗体检测 结果 扫描 自动结果判读,第一节 体液免疫检测 一、免疫球蛋白 免疫球蛋白因其功能和理化性质不同分为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE五大类。 Ig的血清可采用免疫扩散法、免疫透射比浊法、免疫散射比浊法进行测定。 IgD、IgE含量较低，常用ELISA、放射免疫（RIA）、荧光偏振技术、化学发光法进行测定。,（一）免疫球蛋白G 免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)为人体含量最多和最主要的Ig,占总免疫球蛋白的70%-80%，也是唯一能够通过胎盘的Ig，通过天然被动免疫使新生儿获得免疫性抗体。 参考值 IgG：7.0-16.6g/L。,临床意义 1、生理性变化 胎儿出生前可从母体获得IgG，在孕期22-28周间，胎儿血IgG浓度与母体血IgG浓度相等，出生后母体血IgG逐渐减少，到第3-4个月胎儿血IgG降至最低，随后胎儿逐渐开始合成IgG，血清IgG逐渐增加，到16岁前达到成人水平。 2、病理性变化 （1）IgG增高：是再次免疫应答的标志。常见于各种慢性感染、慢性肝病、胶原血管病、淋巴瘤以及自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮（syetem lupus erythematosus, SLE）、类风湿关节炎等；单纯性IgG增高主要见于免疫增殖性疾病，如IgG型分泌型多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）等。 （2）IgG降低：见于各种先天性和获得性体液免疫缺陷病、联合免疫缺陷病、重链病、轻链病、肾病综合征、病毒感染及服用免疫抑制剂的患者。还可见于代谢性疾病，如甲状腺功能亢进和肌营养不良。,（二）免疫球蛋白A 免疫球蛋白A（immunoglobulin A,IgA ）分为血清型IgA和分泌型IgA（SIgA）两种。前者占血清总Ig的10%-15%。 参考值 成人血清IgA为0.7-3.5g/L；SIgA唾液平均为0.3g/L，泪液为30-80g/L，初乳平均为5.06g/L，粪便平均为1.3g/L。,临床意义 生理性变化： 儿童的IgA水平比成人低，且随年龄的增加而增加，到16岁前达成人水平。 病理性变化： （1）IgA增高：见于IgA型MM、SLE、类风湿关节炎、肝硬化、湿疹和肾脏疾病等；在中毒性肝损伤时，IgA浓度与炎症程度相关。 （2）IgA降低：见于反复呼吸道感染，非IgA型MM、重链病、轻链病、原发性和继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾病（如：甲状腺功能亢进、肌营养不良）等。,（三）免疫球蛋白M 免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）是初次免疫应答中的Ig,不论是在个体发育中还是当机体受到抗原刺激后，IgM都是最早出现的抗体。IgM是分子质量最大的Ig,约占血清总Ig的5%-10%。 参考值 成人IgM：0.5-2.6g/L。,临床意义 1、生理性变化 从孕20周起，胎儿自身可合成大量IgM，胎儿和新生儿IgM浓度是成人水平的10%，随年龄的增加而增高，8-16岁前达到成人水平。 2、病理性变化 （1）IgM增高：见于初期病毒性肝炎、肝硬化、类风湿性关节炎、SLE等。由于IgM是初次免疫应答中的Ig，因此单纯IgM增加常提示为病原体引起的原发性感染。宫内感染可能引起IgM浓度急剧升高，若脐血中IgM0.2g/L时，表示有宫内感染。此外，在原发性巨球蛋白血症时，IgM呈单克隆性明显增高。 （2）IgM降低：见于IgG型重链病、IgA型MM、先天性免疫缺陷症、免疫抑制疗法后、淋巴系统肿瘤、肾病综合征及代谢性疾病（如甲状腺功能亢进、肌营养不良）等。,（四）免疫球蛋白E 免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）为血清中最少的一种Ig，约占血清总lg的0.002%，是介导I型变态反应性疾病的抗体。 参考值 成人血清IgE:0.l0.9m/L。,临床意义 1、生理性变化 婴儿脐血IgE水平很低，出生后随年龄增长而逐渐升高，12岁时达到成人水平。 2、病理性变化 （1）IgE增高：见于IgE型MM、重链病、肝脏病、结节病、类风湿性关节炎、特异性皮炎、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、间质性肺炎、荨麻疹、嗜酸性粒细胞增多症、疱疹样皮炎、寄生虫感染、支气管肺曲霉菌等疾病。 （2）IgE降低：见于先天性或获得性丙种球蛋白缺乏症、恶性肿瘤、长期用免疫抑制剂和共济失调性毛细血管扩张症。,（五）M蛋白 M蛋白（M protein）或称单克隆免疫球蛋白，是一种单克隆B细胞增殖产生的具有相同结构和电泳迁移率的免疫球蛋白分子及其分子片段。 参考值 阴性（蛋白电泳法、免疫电泳法或免疫 比浊法）。,临床意义 血清中检测到M蛋白，提示单克隆免疫球蛋白增殖病。见于: (1)多发性骨髓瘤(multiplemyeloma):最为多见，占M蛋白血症的35%65%，其中IgG型占60%左右；IgA型占20%左右；轻链(或，)型占15%左右；IgD和IgE型罕见。 (2)巨球蛋白血症(macroglobulinemia) :占M蛋白血症的9%14%，血、液中存在大量的单克隆19S、24S、27S的IgM，80%的M蛋白为轻链，20%的M蛋白为轻链。本病与多发性骨髓瘤、淋巴瘤和慢性淋 巴细胞白血病有些相似，由于最先由Waldenstrom所描述，因此又名Waldenstrom病。少数患高，7S单体 IgM异常增多，又称7S IgM病。 (3)重链病(heavy chain diseases， HCD):其M蛋白的实质为免疫球蛋白重链合成异常增多。现已发现有重链病、y重链病和重链病等。,(4)轻链病 出现单克隆游离轻链。 (5)半分子病(half-molecule immunoglobulin disease) :由免疫球蛋白一条重链和一条轻链构成的半个Ig分子的单克隆蛋白片段异常增生而导致的疾病，现已发现有IgA类和IgG类半分子病。 (6)恶性淋巴瘤:其血液中可发现有M蛋白。 (7)良性M蛋白血症:是指血清或尿中存在单一免疫球蛋白或其片段，原因不明，长期观察也未见发展 为骨髓瘤或巨球蛋白血症。老年人中发现良性M蛋白血症者较多，应注意与多发性骨髓瘤相鉴别。,二、补体系统 补体(complement，C)是存在于人和脊髓动物血清及组织液中的一组具有酶样活性的糖蛋白，加上其调节因子和相关膜蛋白共同组成一个补体系统。,(一)总补体溶血活性检测 总补体清血活性(complementhemolysis 50 % ，CH50)所反映的主要是补体9种成分(ClC9)的综合水平。 参考值 试管法:50 100k U/L。,临床意义 (1) CH50活性增高:常见于急性炎症、组织损伤、某些恶性肿瘤及妊娠等。 (2) CH50活性降低:常见于急性肾小球肾炎、自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮、类风温关节炎活动 期)、亚急性感染性心内膜炎、慢性肝病、肝硬化、Graves病(毒性弥漫性甲状腺肿)、艾滋病、严重烧伤、冷球蛋白血症、重度营养不良和遗传性补体成分缺乏症等。,(二)补体C1q 补体C1q(complement 1q,C1q)是构成补体C1的重要组分。C1是由一个C1q分子、2个C1r分子和2个C1s分子构成的钙离子以耐性复合物。目前C1q为常规检测项目。 参考值 0.18-0.19g/L（ELISA法）；0.025-0.05g/L。 临床意义 1、C1q增高 见于骨髓炎、类风湿关节炎、痛风、过敏性紫癜等。 2、C1q降低 见于SLE、混合型结缔组织病、重度营养不良、肾病综合征、肾小球肾炎、重症联合免疫缺陷等。,酶联免疫吸附法 (Enzyme-linked Immunosorbant Assay, ELISA),(三)血清补体C3检测 血清补体C3(complement3，C3)是一种由肝脏合成的2球蛋白，由和两条多肽链组成。C3在补体系统各成分中含量最多，是经典途径和旁路途径的关键物质。它也是一种急性时相反应蛋白。 参考值 成人：0. 81. 5g/L,临床意义 (1)血清C3含量增高:常见于一些急性时相反应，如急性炎症、传染病早期、急性组织损伤、恶性肿瘤和移植物排斥反应时增高。 (2)血清C3含量降低见于: 补体合成能力降低，如慢性肝病、肝硬化、肝坏死。 补体合成原料不足，如营养不良(多见于儿童)。 补体消耗或丢失太多，如系统性红斑狼疮活动期、急性链球菌感染后肾小球肾炎、基底膜增殖性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、慢性活动性肝炎、疟疾、冷球蛋白血症、白血病化疗后、血液进行体外循环后、大失血和大面积烧伤等。 先天性补体缺乏，如遗传性C3缺乏症。,（四）血清补体C4检测 血清补体C4(complcment4，C4)是一种多功能1球蛋白。由巨噬细胞和肝细胞合成，相对分子质量为210000，C4作为C 1酯酶的底物，在补体经典途径活化中，在Mg2+的参与下，C4裂解为C4a与C4b两个片段，它们在补体活化、促进吞噬、防止免疫复合物沉着和病毒等方面发挥作用。 参考值 成人：0.200. 60 g/L，,临床意义 1、生理性变化 胎儿出生后随年龄的增长，其血清C4水平逐渐增加，到12岁左右达成人水平。 2、病理性变化 （1）增高：见于各种传染病、急性炎症（如急性风湿热、结节性动脉周围炎、皮肌炎、关节炎）和组织损伤等。 （2）降低：见于自身免疫性肝病、狼疮性肾炎、SLE、I型糖尿病、胰腺癌、多发性硬化症、类风湿关节炎、IgA肾病、遗传性IgA缺乏症。在SLE，C4的降低常早于其他补体成分，且缓解时较其他成分回升迟。,（五）补体旁路B因子 B因子( factor B,BF)是一种不耐热的球蛋白，5030分钟即可失活。补体旁路活化途径中的一个重要成分，它可被D因子裂解为Ba、Bb两个片段，Bb与C3b结合形成C3bBb，即旁路途径的C3转化酶。B因子是补体旁路活化途径中的一个重要成分，又称C3激活剂前体。 参考值 0.100.40g/L。,临床意义 同补体旁路途径溶血活性检测。 1、增高 见于某些自身免疫性疾病、肾病综合征、慢性肾炎、恶性肿瘤。 2、减低 见于肝病、急性肾小球肾炎、自身免疫性你溶血性贫血。,（六）补体结合试验 补体结合试验（complement fixation test，CFT）是用免疫溶血机制作为指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。早在1906年Wassermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。这一传统的试验经不断改进，除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关抗原以及HLA的检测和分析中也有应用。,第二节 细胞免疫检测 人体的淋巴细胞分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞等。 T淋巴细胞和B淋巴细胞还可进一步分为若干亚群。各有其特异的表面标志和功能。 临床上各种免疫疾病均可出现不同群淋巴细胞数量和功能的变化，对它们进行检测可用以判断细胞免疫功能。,一、T细胞亚群的检测 T细胞由一群功能不同的异质性淋巴细胞组成，由于它在胸腺（thymus）内分化成熟故称为T细胞。 在T细胞发育的不同阶段以及成熟T细胞在静止期和活动期，其细胞膜表面分子表达的种类和数量均不相同。这些分子为抗原性不同的糖蛋白，它们与T细胞对抗原的识别、细胞的活化、信息的传递、细胞的增殖和分化以及T细胞的功能相关。 由于这些分子在T细胞表面相当稳定，故可视为T细胞的表面标志，可以用于分离、鉴定不同功能的T细胞。这些分子的单克隆抗体对临床相关疾病的诊断和治疗也具有重要应用价值。,(一)T细胞花结形成试验 T淋巴细胞表面的有特异性的绵羊红细胞(E)受体和T细胞抗原识别抗体（TCR），其中E受体曾广泛被用作鉴定和计数T细胞的标志。T细胞表面受体的E受体，在一定条件下可与绵羊红细胞结合形成像玫瑰花一样的花环，称为E玫瑰花形成试验，(erythrocyte rosette formation test, E-RFT)。显微镜下计数花结形成细胞占淋巴细胞的比例，以每个淋巴细胞黏附3个或3个以上绵羊红细胞着为花结形成细胞。 参考值 ERFT:（64.4+6.7）%,1,1,临床意义 1、降低 见于免疫缺陷性疾病，如恶性肿瘤、免疫性疾病、某些病毒感染、大面积烧伤、多发性神经炎、淋巴增殖性疾病。 2、升高 见于甲状腺功能亢进症、甲状腺炎、重症肌无力、慢性活动性肝炎、SLE活动期及器官移植排斥反应等。,(二)T细胞转化试验 体外培养时，T淋巴细胞被植物血凝素（PHA）或刀豆蛋白A（ConA）刺激，代谢活跃，增加蛋白质、RNA和DNA的合成，从而转化为母细胞，部分细胞发生有丝分裂。用显微镜计数淋巴细胞及转化的母细胞数，求出转化的百分率；也可以用3H-TdR掺入法及液体闪烁仪测定淋巴细胞的脉冲数/分（cpm）值，从而反映T细胞的免疫功能。 参考值 1、形态学法 转化率为（60.1+7.6）%。 2、3H-TdR掺入法 刺激指数（SI）2。,形态学方法,淋巴母细胞主要表现有体积明显增大，是成熟淋巴细胞的3-4倍；染色质疏松，核仁清晰可见；胞浆丰富并形成空泡。 根据细胞的大小，核与胞浆的比例，胞浆的染色性和核结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞，按下式计算转化率：,返回,3H-TdR掺入法,返回,临床意义 同T淋巴细胞花结形成试验。但Down(先天愚型)综合征时明显增高。本试验主要用于体外检测T细胞的生物学功能。反映机体的细胞免疫水平；也用以估计疾病的疗效和预后。,（三）T细胞分化抗原测定 T细胞膜表面有多种特异性抗原，WHO（1986年）统称其为白细胞分化抗原（cluster differentiation,CD）应用单克隆抗体与T细胞表面抗原结合后，再与荧光标记二抗（兔或羊抗鼠IgG）反应，在荧光显微镜下或流式细胞仪中计数CD阳性细胞的百分率。 参考值 T细胞分化抗原测定结果见表4-8-1。,基本过程,表4-8-1 T细胞分化抗原测定结果,临床意义 1、CD3+降低 见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿关节炎等。 2、CD3+/CD4+ 降低 见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷症、艾滋病、应用免疫抑制剂者。 3、CD3+/CD8+降低 见于自身免疫性疾病或变态反应性疾病。 4、CD4+/CD8+增高 见于自身免疫性疾病、病毒性感染、变态反应等。 5、CD4+/CD8+降低 见于艾滋病（常0.5）、恶性肿瘤进行期和复发时。 6、监测器官移植排斥反应时CD4+/CD8+增高预示可能发生排斥反应。 7、CD3+、CD4+ 、CD8+较高且有CD1+、CD2+、CD5+、CD7+增高则可能为T细胞型急性淋巴细胞白血病。,二、B细胞分化抗原检测 应用CDl9、CD20、CD21、CD22等单克隆抗体，分别与B淋巴细胞表面分化抗原(B-lymphocyte cluster differdntation)结合，通过免疫荧光法或流式细胞术进行检测，分别检测出CD19、CD20、CD21、CD22等阳性细胞百分率和B淋巴细胞数。 参考值 流式细胞术：CD19+细胞（11.74+3.37）%。 临床意义 1、升高 见于急性淋巴细胞白血病（B细胞型、且有SmIg、HLA-D表达）、慢性淋巴细胞白血病和Burkitt淋巴瘤。 2、降低 见于无丙种球蛋白血症、使用化疗或免疫抑制剂后。,三、自然杀伤细胞免疫检测 (一)自然杀伤细胞活性测定 目前多采用检测NK细胞活性来研究不同疾病状态下NK细胞的杀伤功能。检测NK细胞活性的方法多种多样，方法的简繁有很大差异，但敏感性和特异性亦异，从简单的活细胞计数至最先进的流式细胞仪分析，一般可根据实验要求和具体条件选用。 参考值 自然杀伤细胞活性测定结果见表4-8-2。,表4-8-2 自然杀伤细胞活性测定结果,临床意义 NK细胞活性可作为判断机体抗肿瘤和抗病毒感染的指标之一。在血液系统肿瘤、实体瘤、免疫缺陷病、艾滋病和某些病毒感染者，NK细胞活性降低；宿主抗移植物反应者，NK细胞活性升高。,(二)抗体依赖性细胞介导的细胞毒测定 抗体依赖性细胞介导的细胞毒（antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC）特异性由抗体决定。这类细胞表面有抗体Fc受体，当与相应的抗体结合后，抗体被激活，ADCC细胞得以与抗体的Fc受体结合，引起靶细胞的杀伤与破坏。 参考值 51 Cr释放法：51 Cr释放率10%为阴性，10%20%为可疑阳性，20%为阳性；溶血空斑法5.6%为阴性。,51 Cr释放法,临床意义 1、增高 见于自身免疫性疾病，如自身免疫性血小板减少症、自身免疫性溶血性贫血、免疫性粒细胞缺乏症，甲状腺功能亢进，移植排斥反应等。 2、降低 见于恶性肿瘤、免疫缺陷病、慢性肝炎、肾功能衰竭等。,四、细胞因子检测 细胞因子（cytokine，CK）是一类由免疫细胞（淋巴细胞、单核巨噬细胞等）和相关细胞（成纤维细胞、内皮细胞等）产生的调节细胞功能的高活性、多功能、低分子蛋白质，属于分泌性蛋白质，不包括免疫球蛋白、补体和一般生理性细胞产物。细胞因子检测是判断机体免疫功能的一个重要指标。 目前，常见细胞因子有白细胞介素（IL-2、IL-4、IL-6、IL-8）、肿瘤坏死因子、干扰素、集落刺激因子、红细胞生成素等，但是由于细胞因子在体内的含量甚微，给细胞因子的检测带来困难。,（一）IL-2活性及其受体测定 白介素-2（interleukin-2,IL-2）是白细胞介素中的一种。主要由活化T细胞产生，是具有多向性作用的细胞因子（主要促进淋巴细胞生长、增殖、分化）。它对机体的免疫应答和抗病毒感染等有重要作用。 参考值 IL-2：3H-TdR掺入法为515kU/L。,临床意义 1、IL-2 随年龄的增长，有降低的趋势。 （1）增高：见于自身免疫性疾病（SLE、类风湿关节炎等）、再生障碍性贫血、多发性骨髓瘤、排斥反应等。 （2）降低：见于免疫缺陷病（艾滋病、联合免疫缺陷等）、恶性肿瘤、I型糖尿病、某些病毒感染等。 2、IL-2R 对急性排斥反应和免疫性疾病有诊断意义，可作为病情观察和药物监测的一项指标。,（二）肿瘤坏死因子测定 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）分为TNF和TNF两型。前者来源于单核细胞、吞噬细胞；后者来源于T淋巴细胞。两型的结构虽然不同，但生物活性类似。两型都有引起肿瘤组织出血、坏死和杀伤作用，都可引起抗感染的炎症反应效应，以及对免疫细胞的调节、诱生作用。 参考值 （4.3+2.8）ug/L（ELISA法）。 临床意义 TNF有炎症介质作用，能阻止内毒素休克、DIC的发生；有抗感染效应，抑制病毒复制和杀伤病毒感染细胞；有抗肿瘤作用，杀伤和破坏肿瘤细胞。血中TNF水平增高特别对某些感染性疾病（如脑膜炎球菌感染）的病情观察有价值。,（三）干扰素测定 干扰素（interferon，IFN）是宿主细胞受病毒感染后产生的一种非特异性防御因子，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、控制细胞增殖的作用。 参考值 14kU/L（ELISA法）。 临床意义 1、增高 见于SLE、非活动性类风湿关节炎、恶性肿瘤早期、急性病毒感染、再生障碍性贫血等。 2、降低 见于乙肝及携带者、哮喘、活动性类风湿关节炎等。,第四节 临床常用的肿瘤标志物检查 肿瘤标志物(tumormarker，TM)是由肿瘤细胞的基因表达而合成分泌的或是由机体对肿瘤细胞反应而异常产生和(或)升高的，反映肿瘤存在和生长的一类物质。 肿瘤标志物存在于患者的血液、体液、细胞或组织中，反应肿瘤的存在和生长，通过化学、免疫学以及基因组学等方法测定肿瘤标志物，对肿瘤的诊断、疗效和复发的监测、预后的判断具有一定的价值。 肿瘤标志物主要包括蛋白质类、糖类和酶类标志物。,一、蛋白质类肿瘤标志物检测 (一)甲胎蛋白检测 甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)是在胎儿早期由肝和卵黄囊合成的一种血清糖蛋白，出生后，AFP合成很快受到抑制。 当肝细胞或生殖腺胚胎组织发生恶性病变时，有关基因重新被激活，致使血中AFP含量明显升高。因此血中AFP浓度监测对诊断肝细胞癌及滋养细胞恶性肿瘤有重要的临床意义。 参考值 25g/L（CLIA化学发光免疫分析、RIA放射免疫分析、ELISA酶联免疫吸附试验）。,化学发光免疫分析仪,化学发光免疫测定原理,以化学发光剂、催化发光酶或产物间接参与发光反应的物质等标记抗体或抗原，标记抗体或标记抗原与相应抗原或抗体结合，发光底物受发光剂、催化酶或参与产物作用，发生氧化还原反应，反应中释放可见光或者该反应激发荧光物质发光，最后用发光光度计进行检测,化学发光免疫分析的类型,化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay,CLIA) 化学发光酶免疫分析（chemiluminescent enzyme immunoassay ） 电化学发光免疫测定（electrochemilum- inescence immunoassay, ECLIA ）,化学发光免疫分析技术,化学发光酶免疫分析,原理 属于酶免疫测定中的一种，反应所用底物为发光剂，通过发光反应发出的光在特定的仪器上进行测定 技术类型 HRP 标记的CLEIA 增强发光酶免疫分析 ALP标记的CLEIA,洗涤 弃上清,CLEIA原理图,德国拜耳（BaYer）公司生产的全自动化学发光免疫分析仪(ACS-180SE)。这台检测新设备是使用最新的化学发光技术，检测灵敏度达 10-15/ml。,肿瘤标志物“免疫速检” 适用于一般门诊病人体检、肿瘤病人检查及健康人群的体检。项目包括：AFP、CEA、CA-199、CA-153、CA-125、HCG、PSA、CPSA、FE，这些项目均为定量检测，一小时出结果。,Ru(bpy)32+,Ru(bpy)33+,TPA,阳离子自由基TPA+.,阳电极表面,自由基TPA.,Ru(bpy)32+* （激发态）,氧化,氧化,失质子,还原剂,发射光子,电化学发光免疫分析,电化学发光免疫测定技术,RIA 放射免疫分析基本原理,标记抗原（Ag*）和 非标记抗原（Ag）与限 量抗体(Ab)竞争性结合 Ag*和Ag具有等同的 与Ab结合能力,Ab限量，Ag*定量, Ag*和Ag的量大于 Ab结合位点，二者 通过竞争方式与Ab 结合；随着Ag增加，Ag*与Ab结合形成Ag*Ab复合物的放 射量降低,二者变化 成函数关系。,以未结合的Ag*为 F，Ag*Ab复合物 为B，则B/F或 B/(BF)与Ag的 量变存在着函数 关系剂量反应 曲线,注：T即是B与F的总和,放射免疫分析实验方法及测定,抗原抗体反应,Ag*,Ag,反应条件 体积 温度 时间 pH,Ab,(标准Ag/样品Ag),平衡 非平衡 一步法 二步法,分离结合、游离标记物,二抗体沉淀法,PEG 沉淀法,PR 试剂法,活性炭吸附法,分离彻底，迅速 分离试剂和过程不影响反应平衡 效果不受反应介质影响 操作应简单、重复性好 经济,测量、数据处理,晶体闪烁计数器 包括了NaI闪烁晶 体、光电倍增管 以及计数器 测量的放射性信 号是仪器输出的 电脉冲数：每分 钟计数(cpm),计算,参数 cpm B/T (%) F/T (%) B/F (%) B/B0 (%),拟合,注：T即是B与F的总和,临床意义 1)原发性肝细胞癌患者血清中AFP明显升高，阳性率为67.8% 74. 4%。约有50%患者AFP 300 ug/L，但也有18%的肝癌患者AFP不升高，值得注意。 2)生殖腺恶性肿瘤（辜丸癌、卵巢癌、畸胎瘤等）、胃癌或胰腺癌时血中AFP含量也可升高。 3) 病毒性肝炎、肝硬化患者AFP有不同程度升高，但其水平常300g/L。 4）妇女妊娠34个月，孕妇AFP开始升高，78个月时达到高峰，一般在400ug/L以下，分娩后3周恢复正常。胎儿神经管畸形、双胎、先兆流产等均会使孕妇血液和羊水中AFP升高。,(二)癌胚抗原检测 癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)最初发现于成人结肠癌组织中，是一种富含多糖的蛋白质复合物。 早期胎儿的胃肠道及某些组织细胞具有合成CEA的能力，但妊娠六个月以后含量极低。 CEA是一种广谱肿瘤标志物，可在多种肿瘤中表达，脏器特异性低，在临床上主要用于辅助恶性肿瘤的诊断、判断预后、监测疗效和肿瘤复发等。 参考值 5ug/L（CLIA，RIA、ELISA）。,临床意义 (1)血清CEA升高 主要见于结肠癌、直肠癌、乳癌、胃癌、肺癌及胰腺癌等，其他恶性肿瘤也有不同程度的阳性率。 (2)动态观察 一般病情好转时血清CEA浓度下降，病情恶化时升高。 (3)结肠炎、胰腺炎、肝脏疾病、肺气肿及支气管哮喘等也常见CEA轻度升高。 (4) 96%97%的非吸烟健康人血清CEA浓度2.5g/L，少数人5.0g/L。,(三)组织多肽抗原检测 组织多肽抗原(tissue polypeptide antigen，TPA）是存在于胎盘和大部分恶性肿瘤组织中的一种单链多肽，在恶性肿瘤患者的血清中的检出率高达70%以上，但它的高度与肿瘤发生部位和组织类型无相关性。 血液内TPA水平与细胞分裂增殖程度密切相关，恶性肿瘤细胞分裂、增殖活跃，所以血清中TPA水平增高，临床上常用于辅助诊断迅速增殖的恶性肿瘤，特别是对已知肿瘤的疗效监测。 参考值 130 U/L（ELISA）。,临床意义 (1)恶性肿瘤患者血清TPA水平显著升高。 (2)经治疗好转后，TPA水平降低；若TPA再次升高，提示肿瘤复发。 (3)TPA和CEA同时检测可有利于恶性与非恶性乳腺肿瘤的鉴别诊断。 (4)急性肝炎、胰腺炎、肺炎、妊娠的最后3个月均可见TPA升高。,(四)前列腺特异性抗原检测 前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)是一种由前列腺上皮细胞分泌的单链糖蛋白，它存在于前列腺管道的上皮细胞中，在前列腺癌时可见血清中PSA水平显著升高。血清总PSA(t-SPA)中有 80%的PSA以各种结合的形式存在，称为复合PSA(c-PSA) ;20%的PSA以未结合的形式存在，称为游离 PSA(f-PSA)。t- PSA ，f- PSA升高，而f- PSA/ t- PSA比值降低，提示前列腺癌。 参考值 t-PSA0.25。,临床意义 (1)前列腺癌时60%90%患者血清t-PSA水平明显升高；当行外科切除术后，90%患者血清t-PSA水平明显降低。 （2）若前列腺切除术后t-PSA浓度无明显降低或再次升高，提示肿瘤转移或复发。前列腺增生、前列腺炎等良性疾病，约有14%的患者血清t-PSA轻度升高(一般在4.010. 0ug/L)，此时应注意鉴别。 （3）当t-PSA处于4.010. 0ug/L时，f-PSA/t-PSA比值对诊断更有价值。f-PSA/t-PSA10%提示前列腺癌。 （4）肝门指诊、前列腺按摩、膀胱镜等检查及前列腺手术会引起前列腺组织释放PSA而引起血清浓度升高，建议在上述检查前后检查后数日、手术后数周进行PSA检查。,(五)鳞状细胞癌抗原检测 鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen, SCC)是肿瘤相关抗原TA-4的亚型，是一种糖蛋白。 参考值 1. 5ug/L（RIA、CLIA）。,临床意义 (1)血清中SCC水平升高，可见于25%75%的肺鳞状细胞癌，30%的I期食管癌，89%的期食管癌，83%的宫颈癌。血清SCCA浓度与宫颈鳞癌分期、肿瘤体积、治疗后肿瘤残余、肿瘤复发和病情进展、肿瘤患者生存率有关，美国国家临床生化学会（National Academy of Clinical Biochemistry，NACB）推荐SCCA用于宫颈癌患者的预后评估、监测疗效和肿瘤复发。临床上也常用于监测肺鳞状细胞癌、食管癌等的治疗效果、复发、转移或评估预后。 (2)部分良性疾患如银屑病、天疱疮、特异性皮炎等皮肤疾病、肾功能不全、良性肝病、乳腺良性疾病、上呼吸道感染性疾病等也可引起SCCA浓度升高。 (3)SCCA不受性别、年龄、吸烟的影响，但因它在皮肤表面的中层细胞内高浓度存在，因而由采血技术可引起假阳性。此外，汗液、唾液或其他体液污染亦会引起假阳性。,二、糖脂类肿瘤标志物检测 (一)癌抗原50测定 癌抗原50（cancer antigen 50，CA50）是一种肿瘤糖类相关抗原，主要由唾液酸糖脂和唾液酸糖蛋白所组成。它对肿瘤的诊断无器官特异性。 参考值 2.0万U/L（IRMA、CLIA）。 临床意义 1、增高 见于87%的胰腺癌，80%的胆（道）囊癌，73%的原发性肝癌，50%的卵巢癌，20%的结肠癌、乳腺癌、子宫癌等。 2、动态观察其水平变化对癌肿瘤疗效及预后的判断、复发检测颇具价值。 3、对鉴别良性和恶性胸、腹水有价值。 4、在慢性肝病、胰腺炎、胆管病时，CA50也升高。,（二）癌抗原724测定 癌抗原724（cancer antigen 724，CA724）是一种肿瘤相关糖蛋白（tumor associated glycoprotein），它是胃肠道和卵巢肿瘤的标志物。 参考值 6.7ug/L（CLIA、RIA、ELISA）。 临床意义 1、增高 见于67%的卵巢癌、47%的大肠癌、45%的胃癌、40%的乳腺癌、42%的胰腺癌。 2、CA724与CA125联合检测，可提高卵巢癌的检出率。 3、CA724与CEA联合检测，可以提高诊断胃癌的敏感性和特异性。但是，正常人和良性胃肠道疾病的阳性率分别为3.5%和6.7% 。,（三）糖链抗原199测定 糖链抗原199 (carbohydrate antigen 199，CA199)是一种糖蛋白，属于唾液酸化Lewis血型抗原。正常人唾液腺、前列腺、胰腺、乳腺、胃、胆管、胆囊、支气管上皮细胞存在微量CA199。 参考值 3.7万 U/L（CLIA、RIA、ELISA）。,临床意义 胰腺癌、肝胆和胃肠道疾病时血中CA199的水平可明显升高。 (1)目前认为，CA199是胰腺癌的首选肿瘤标志物，胰腺癌早期，当特异性为95%时，敏感度可达80%90%，若与CEA同时测定，敏感度还可进一步提高。 (2)约有5%10%的人不表达Lewis类抗原，因此部分胰腺癌患者CA199的血清浓度不升高。 (3)诊断胆囊癌和胆管癌的阳性率为85%左右，胃癌、结肠癌为40%，直肠癌为30%50%；但无早期诊断价值，对早期患者的敏感度仅为30%。 (4)连续检测对病情进展、手术疗效、预后估计及复发诊断有重要价值。 (5)急性胰腺炎、胆计淤积型胆管炎、胆石症、急性肝炎、肝硬化等疾病，血清CA 199也有不同程度的升高。 (6)若结合CEA检测，对胃癌诊断符合率可达85%。,（四）癌抗原125测定 癌抗原125(cancer antigen 125，CA125)是一种糖蛋白性肿瘤相关抗原，存在于上皮性卵巢癌组织和患者的血清中，在胎儿体腔上皮分泌物及羊水中以及成人的输卵管、子宫及宫颈内膜也可发现CA125。 参考值 3.5万U/L（CLIA、RIA、ELISA）。,临床意义 (1)CA125存在于卵巢癌组织细胞和浆液性腺癌组织中，不存在于粘液性卵巢癌中。卵巢癌上皮癌患者的CA125浓度可明显升高，早期诊断和复发诊断的敏感性可达50%90%，故对诊断卵巢癌有较大临床价值，尤其对观察治疗效果和判断复发较为灵敏。 (2)盆腔肿瘤的鉴别。CA125可用于鉴别卵巢包块，特别适用于绝经后妇女。 (3)宫颈癌、乳腺癌、胰腺癌、胆道癌、肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌等也有一定的阳性反应。 (4)3%6%的良性卵巢瘤、子宫肌瘤患者血清CA125有时也会明显升高，但多数不超过10万U/L。 (5)肝硬化失代偿期血清CA125明显升高。 (6)生理状态下，如早孕期（3个月）CA125也可升高。,（五）癌抗原242测定 癌抗原242测定（cancer antigen 242，CA242）是一种唾液酸碳水化合物，与CA50来自相同的大分子，但结构各异，它能识别CA50和CA199的抗原决定簇。 参考值 20kU/L（ELISA）。 临床意义 增高见于68%79%的胰腺癌、55%88%的结肠癌、44%的胃癌，也可见于5%33%的非恶性肿瘤。此外，卵巢癌、子宫癌和肺癌的阳性率较CA50高。,（六）癌抗原153测定 癌抗原153（cancer antigen 153，CA153）是抗原决定簇、糖和多肽组成的糖蛋白。 参考值 2.5万U/L（CLIA、RIA、ELISA）。,临床意义 1、乳腺癌时，30%50%的患者可见CA153明显升高，但在早期乳腺癌时，它的阳性率仅为20%30%左右，因此它不能用于筛查与早期诊断，主要用于乳腺癌患者的治疗监测和预后判断。乳腺癌患者血清CA153浓度比原来水平升高预示病情进展、肿瘤复发、转移，其浓度升高比临床症状出现或影像学检查的发现时间早。 2、血清CA153浓度升高还可见于子宫肿瘤、转移性卵巢癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、肺癌、支气管肺癌。 3、乳腺、肝脏、肺等的良性疾病时，CA153血清水平也可见不同程度的增高。,三、酶类肿瘤标志物检测 （一）前列腺酸性磷酸酶检测 前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase，PAP)是一种前列腺外分泌物中能水解磷酸酯的糖蛋白。 参考值 2.0ug/L（RIA、CLIA）。 临床意义 (1)前列腺癌时，血清PAP浓度明显升高，其