[临床医学]苦参碱抑制宫颈癌HeLa细胞增殖作用及机制.ppt

苦参碱对宫颈癌HeLa细胞的作用,摘自齐鲁医学杂志,2,摘要,目的： 探讨苦参碱对人宫颈癌HeLa细胞体外增殖的抑制作用及其分子机制。,3,摘要,方法： 以不同浓度(0.5, 1.0, 1.5,2.0 g/L)的苦参碱分别处理Hela细胞24、48、72h后，应用MTT法检测细胞增殖抑制率，WesternBlot方法检测培养48h细胞中真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）、4E结合蛋白1（4E-BP1）蛋白表达情况。,4,摘要,方法： 1. 0 g/L的苦参碱作用Hela细胞1、3、6、12 h后，Western Blot方法测其eIF4E、4E-BP1蛋白磷酸化水平。,5,摘要,结果： 苦参碱明显抑制Hela细胞增殖，呈时间和剂量依赖性： 在相同时间内，随着苦参碱浓度的增加，Hela细胞的增殖抑制率明显升高(P0. 05); 2.0 g/L.苦参碱作用72 h对Hela细胞增殖抑制率最大，为(65. 30士2. 17)%。 在同一浓度时，随着苦参碱作用时间的延长，Hela细胞的增殖抑制率也明显升高(P0.05);,6,摘要,结果： 不同浓度苦参碱处理Hela细胞48h后，eIF4E、4E-BP1蛋白的表达均无明泉变化(P0.05)。 1. 0 g/L苦参碱作用于Hela细胞不同时间后，细胞eIF4E、4E-BP1蛋白磷酸化水平均降低，且呈时间依赖性(P0.01)。,7,摘要,结论： 苦参碱可以明显抑制体外培养宫颈癌Hela细胞的增殖，其作用可能是通过抑制eIF4E以及4E-BP1的磷酸化，从而抑制蛋白翻译来实现的。,8,关键词,苦参碱; Hela细胞; 真核细胞翻译起始因子4E; 4E结合蛋白1,9,苦参碱(Matrine)化学分子式为C15H24N20,是从中药苦参的干燥根中提取的具有抗病毒、抗感染、平喘、增强机体免疫力、升高白细胞、保肝等广泛药理作用的活性物质。,简 介,10,近年来研究表明，苦参碱还具有明显的体内、体外抗肿瘤作用，在肝癌、胃癌、肺癌、白血病中均能明显抑制肿瘤细胞的增殖且没有化疗药物的毒副作用。但是，关于苦参碱的抗肿瘤作用的机制研究较少，尤其是苦参碱对肿瘤细胞中蛋白质翻译通路的影响研究更少。,简 介,11,本研究选择人宫颈腺癌HeLa细胞作为研究对象，将调控细胞增殖信号通路中重要因子真核细胞翻译起始因子4E、4E结合蛋白1作为研究切入点，探讨苦参碱对体外培养的HeLa细胞增殖的影响及其可能的分子机制，以探讨其在妇科恶性肿瘤治疗中的应用价值。,简 介,12,材料与方法,实验材料 HeLa细胞株，由第三军医大学野战外科研究所保存。 苦参碱购白西安飞达生物公司。 DMEM高糖培养基、胎牛血清为Gibco公司产品。 四甲基偶氮唑蓝(MTT)由美国Sigma公司提供。 eIF4E、磷酸化的eIF4E ( p-eIF4E) 、 4E-BPl、磷酸化的4E-BP1(p-4E-BP1)抗体均购自Cell Signa-ling公司。 肌动蛋白抗体购自北京四正柏生物科技有限公司。,13,材料与方法-实验方法,细胞株培养 HeLa细胞培养于含体积分数0. 10胎牛血清的DMEM高糖培养基中(下称完全培养基)，置37、含体积分数0. 05 CO2、饱和湿度培养箱中培养，待细胞长至融合度为80%90%传代，所有实验均采用对数生长期细胞。,14,材料与方法-实验方法,MTT法检测HeLa细胞增殖抑制率 将HeLa细胞6×103个/孔接种于96孔培养板，细胞贴壁后分别加入终浓度为0.5,1.0,1.5,2.0 g/L的苦参碱处理细胞，对照组加入等体积无血清培养基，使每孔终体积为200L，空白调零组只加200L的完全培养基，每组设6个复孔。,15,材料与方法-实验方法,MTT法检测HeLa细胞增殖抑制率 继续培养24,48,72h后，加入5g/L的MTT 20L,37孵育4h,弃上清，每孔加入200L的DMEM，振荡使结晶溶解，上机检测490 nm波长处吸光度(A)值，计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率=(1一实验组平均A值/对照组平均A值)×100%。实验重复3次，取平均值。,16,材料与方法-实验方法,Western Blot检测eIF4E、4E-BP1蛋白表达 HeLa细胞2×105个/孔接种于96孔板，贴壁后分别用终浓度为0.5,1.01.5,2.0 g/L的苦参碱处理细胞，作用48 h后终止培养，常规收集细胞蛋白，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转移至PVDF膜上，50g/L脱脂奶粉室温封闭2h，加入一抗(稀释比例按说明书进行)。,17,材料与方法-实验方法,Western Blot检测eIF4E、4E-BP1蛋白表达 4孵育过夜,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG(1:10000)，室温孵育2h，每次孵育后用加Tween的Tris-HC1缓冲盐溶液(TBST)洗膜3次，每次10min。,18,材料与方法-实验方法,Western Blot检测eIF4E、4E-BP1蛋白表达 化学发光试剂(ECL)显色，在X线洗片机(HQ-320XT)上曝光，实验重复3次。以-actin为内参，应用图像分析软件对特异性条带做定量分析，以目标条带与内参的A值比反映蛋白相对表达量。,19,材料与方法-实验方法,Western Blot检测eIF4E、4E-BP1蛋白的磷酸化水平 HeLa细胞2×105个/孔接种于96孔板，贴壁后，实验组加入终浓度为1. 0 g/L的苦参碱，分别作用1,3,6,12 h后终止培养，提取细胞总蛋白，用特异性磷酸化抗体分别检测p-eIF4E（Ser209)、p-4E-BP1(Thr37/46)蛋白表达水平。,20,统计学处理 应用SPSS 16.0及PPMS 1.5统计学软件进行数据处理，数据间比较采用方差分析，两两比较采用LSD法。,统计学处理,21,苦参碱对HeLa细胞增殖的影响 在相同作用时间下，随着苦参碱浓度的增加，HeLa细胞的增殖抑制率明显升高，差异有显著意义(P0.05)。 在同一浓度下，随着苦参碱作用时间的延长，HeLa细胞的增殖抑制率逐渐升高(P0.05)。,结果,22,苦参碱对HeLa细胞增殖的影响 苦参碱浓度和作用时间对HeLa细胞增殖抑制率的影响有交互作用(P0. 05)，其中2.0 g/L苦参碱作用72 h对HeLa细胞增殖抑制率达到最大，为(65.30±2.17)%。见表1。,结 果,23,结 果,24,苦参碱对eIF4E 以及4E-BP1蛋白表达的影响 不同浓度的苦参碱作用于HeLa细胞48 h后，苦参碱组eIF4E、4E-BP1蛋白的表达与对照组比较，差异无显著性(P0.05)，见图1、表2。,结 果,25,图1 不同浓度苦参碱对HeLa细胞蛋白水平的影响,结 果,26,结 果,27,苦参碱对eIF4E、4E-BP1蛋白磷酸化水平影响 浓度为1.0 g/L的苦参碱作用于HeLa细胞不同时间后，其eIF4E、4E-BP1的磷酸化水平较对照组均明显降低(P0.01)，且呈时间依赖性，随作用时间的延长，差异逐渐增大。见图2、表3。,结 果,28,结果,图2 1.0g/L 苦参碱作用不同时间对HeLa细胞中蛋白磷酸化水平的影响,29,结 果,30,宫颈癌的发病率在妇科恶性肿瘤中居首位，化疗是其治疗的重要手段之一，常规化疗药物的毒副作用限制了其应用，而中药因为毒性小成为抗肿瘤研究热点。苦参碱属喹诺里西啶类，是中药苦参含量最高的生物碱成分之一。此外，苦参碱对多药耐药细胞株也具有诱导凋亡作用。但是关于苦参碱在宫颈癌中应用的研究较少。,讨 论,31,蛋白质翻译的调控影响了包括细胞的增殖、生存和死亡在内的重要过程。其中，eIF4E是依赖性帽mRNA翻译过程中的限速因子，诸多研究表明其可以诱导细胞恶性转化和肿瘤发生，且与肿瘤的侵袭转移能力及病人分期、预后相关。本研究结果显示，苦参碱对HeLa细胞eIF4E蛋白表达无明显影响，但是对其磷酸化水平具有明显的抑制作用。,讨 论,32,而FAN等的研究表明，p-eIF4 E是eIF4E蛋白活化形式，可以识别帽状结构并促进翻译起始，提示苦参碱可能并不影响肿瘤细胞中eIF4E的表达，而是通过降低eIF4E磷酸化水平来抑制蛋白翻译，从而发挥抑制细胞增殖的作用。,讨 论,33,本研究结果还显示，苦参碱可明显降低HeLa细胞中4E-BP1的磷酸化水平，而对4E-BP1的总蛋白表达量无明显影响，这使得细胞中去磷酸化4E-BP1含量增多，而去磷酸化的4E-BP1可以与eIF4E结合，阻止eIF4F翻译起始复合物的形成，从而阻止mRNA的翻译，提示苦参碱可能通过抑制4E-BP1及eIF4E磷酸化而抑制HeLa细胞的蛋白翻译起始过程。,讨 论,34,目前研究结果显示，参与4E-BP1和eIF4E活性调控的上游信号通路主要有Akt/mTOR及MAPK两条信号通路，而苦参碱究竟是作用于哪条信号通路继而影响蛋白翻译尚需进一步的研究。总之，苦参碱能明显抑制体外培养HeLa细胞的增殖，该作用可能是通过下调eIF4E与4 E-BP 1的磷酸化水平，从而抑制蛋白质的翻译起始阶段来实现的。随着苦参碱抗肿瘤机制的明确，其临床应用将更加广泛，有望成为新型抗肿瘤药物。,讨 论,Thank You !,