二氧化硅纳米颗粒的抗肿瘤药物载体研究硕士学位.doc

硕士学位论文 基于二氧化硅纳米颗粒的抗肿瘤药物载 体研究 A Novel Anticancer Drug Carrier System Based on Silica Nanoparticles by HAI Luo B.S. (Hunan University) 2007 A thesis submitted in partial satisfaction of the Requirements for the degree of Master of Science in Biochemistry and molecular biology in the Graduate School of Hunan University Supervisor Professor He Xiaoxiao Aptamer; Drug carrier; Silica nanoparticles (SiNP); Sodium fluoride (NaF); Doxorubicin (DOX); Pingyangmycine (PYM) 基于二氧化硅纳米颗粒的抗肿瘤药物载体研究 VI 目 录 学位论文版权使用授权书 .I 摘 要II ABSTRACTIV 第 1 章 绪论.1 1.1 抗肿瘤药物载体研究的重要性.1 1.1.1 癌症治疗的主要方法.1 1.1.2 抗肿瘤药物剂型研究的发展过程.2 1.1.3 纳米抗肿瘤药物载体的发展3 1.2 纳米抗肿瘤药物载体及其应用.3 1.2.1 脂质体.3 1.2.2 壳聚糖.7 1.2.3 聚合物颗粒.9 1.2.4 二氧化硅纳米颗粒.13 1.3 本论文的构思.18 第 2 章 基于磷酸化修饰的二氧化硅纳米颗粒药物缓释载体研究.21 2.1 前言.21 2.2 实验部分.21 2.2.1 试剂和仪器.21 2.2.2 磷酸化修饰的包裹平阳霉素二氧化硅纳米颗粒的制备.23 2.2.3 不同量磷酸硅烷化试剂制备的包裹平阳霉素二氧化硅纳米颗粒的表征.23 2.2.4 不同量磷酸硅烷化试剂制备的包裹平阳霉素二氧化硅纳米颗粒的平阳霉素 释放行为考察.23 2.2.5 磷酸化修饰的包裹平阳霉素二氧化硅纳米颗粒性能考察.23 2.3 结果与讨论.24 2.3.1 不同量磷酸硅烷化试剂修饰的包裹平阳霉素二氧化硅纳米颗粒的透射电 镜成像.24 2.3.2 不同量磷酸硅烷化试剂修饰的包裹平阳霉素二氧化硅纳米颗粒的 电位.25 2.3.3 不同量磷酸硅烷化试剂修饰的包裹平阳霉素二氧化硅纳米颗粒的平阳霉 素释放情况.26 2.3.4 30L 磷酸硅烷化试剂制备的包裹平阳霉素二氧化硅纳米颗粒的性能27 2.4 小结.28 第 3 章 基于氟化钠催化的包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒的制备研究.30 3.1 前言.30 硕士学位论文 VII 3.2 实验部分.30 3.2.1 试剂和仪器.30 3.2.2 氟化钠催化二氧化硅纳米颗粒的可行性研究.32 3.2.3 氟化钠/氨水催化合成的包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒的制备32 3.2.4 氟化钠/氨水催化合成的包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒的荧光性质表征32 3.2.5 不同功能基团修饰的包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒的制备.33 3.2.6 不同功能基团修饰的包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒的性质考察.33 3.2.7 羧基化修饰的包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒性质研究.34 3.3 结果与讨论.34 3.3.1 氟化钠催化二氧化硅纳米颗粒形成的可行性研究.34 3.3.2 阿霉素的包裹浓度的优化.37 3.3.3 不同功能基团修饰的包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒缓释性能的考察.38 3.3.4 羧基化修饰的包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒性质研究.41 3.4 小结.43 第 4 章 修饰核酸适体的包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒用于肿瘤的靶向成像与治疗研究.44 4.1 前言.44 4.2 实验部分.44 4.2.1 试剂和仪器.44 4.2.2 药物载体羧基化二氧化硅纳米颗粒生物相容性考察.46 4.2.3 未修饰核酸适体的羧基化包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒对肿瘤细胞杀伤 效果的评价.46 4.2.4 羧基化包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒表面核酸适体的修饰.46 4.2.5 修饰核酸适体的羧基化包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒对肿瘤细胞特异性 识别效果的考察.47 4.2.6 修饰核酸适体的羧基化包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒对肿瘤细胞靶向杀 伤效果的评价.47 4.2.7 碘化丙啶染色检测细胞活性47 4.3 结果与讨论.48 4.3.1 药物载体毒性的考察.48 4.3.2 载药体系非特异性杀伤效果的细胞评价.48 4.3.3 核酸适体修饰的原理.49 4.3.4 核酸适体连接的二氧化硅纳米颗粒对细胞识别效果的考察.50 4.3.5 核酸适体连接的二氧化硅纳米颗粒对细胞毒性的考察.51 4.3.6 碘化丙啶染色检测细胞活性.52 4.4 小结.53 基于二氧化硅纳米颗粒的抗肿瘤药物载体研究 VIII 结 论.55 参考文献.56 致 谢.65 硕士学位论文 IX 本文所用英文缩写词表 缩略词缩略词名称名称缩略词缩略词名称名称 APS N-(-氨乙基)-氨丙基三 乙氧基硅烷 PYM平阳霉素 CEM 人急性白血病 T 淋巴细 胞 PAMAM聚酰胺 COOH-SiNP 羧基化二氧化硅纳米颗 粒 PEG-DOX-SiNP 聚乙二醇包裹阿霉素二氧化 硅纳米颗粒 COOH-DOX-SiNP 羧基化包裹阿霉素二氧 化硅纳米颗粒 PO4-DOX-SiNP 磷酸化包裹阿霉素二氧化硅 纳米颗粒 DOX阿霉素PO4-PYM-SiNP 磷酸化包裹平阳霉素二氧化 硅纳米颗粒 EDC 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙 基)-碳化二亚胺 RES网状内皮系统 FDA 美国食品药品监督管理 局 SiNP二氧化硅纳米颗粒 MES 2-甲氧基（聚乙二醇）- 丙基三甲氧基硅烷 Sgc8c-DOX-SiNP 核酸适体 Sgc8c 修饰的包裹 阿霉素二氧化硅纳米颗粒 MTS CellTiter 96®AQueous 单 溶液细胞增殖检测试剂 盒 TEOS正硅酸乙酯 NH2-DOX-SiNP 氨基化包裹阿霉素二氧 化硅纳米颗粒 TEM透射电子显微镜 NHSN-羟基琥珀酰亚胺Triton X-100曲拉通 PI碘化丙啶THPMP 3-(三羟基硅基)丙基甲基磷酸 酯钠盐 PEG聚乙二醇TSEA N-(丙基三甲氧基硅烷)-乙二 胺-三乙酸钠 硕士学位论文 1 第第 1 章章 绪论 1.1 抗肿瘤药物载体研究的重要性 近年来，随着全球经济的飞速发展，人类的生活习惯和行为模式发生了巨大的改 变，加之工农业发展过程带来的环境污染和人口老龄化等原因，目前癌症正在超过心 脑血管疾病而成为威胁人类安全的头号杀手1。近年来肿瘤的发病率日见增长， Stewart等2发布的世界癌症报告指出每年全世界大约新增癌症患者一千万例。2000年 世界恶性肿瘤(癌症)发病人数为1006万，死亡62l万，现患人数为224l万。发病率与死 亡率比10年前增长约22。2007年，有790万人死于癌症，约占全球死亡人数的13%。 预计2015年全世界将有900万人死于癌症，2030年将有1200万人死于癌症。在所有癌症 的死亡病例中，有70发生在中等收入和低收入国家。因此癌症的控制是世界各国政 府的卫生战略重点，癌症的治疗成为世界所关注的研究课题。本章在简要介绍几种癌 症治疗手段的基础上，重点综述各种抗肿瘤药物载体的研究进展，并在此基础上提出 本论文拟开展的工作。 1.1.1 癌症治疗的主要方法 1.1.1.1 手术治疗 手术治疗是许多早、中期实体肿瘤最主要的有效治疗方法，约60的实体瘤以手 术作为主要治疗手段3。某些局限性肿瘤单用手术即可治愈，但手术也有它的局限性， 由于恶性肿瘤生长快，表面没有包膜，它和周围正常组织没有明显的界限，局部浸润 厉害，并可通过淋巴管转移。因此，手术要把肿瘤及其周围一定范围的正常组织和可 能受侵犯的淋巴结彻底切除。故手术可造成一定程度的功能障碍，甚至残疾；对瘤周 围涉及重要器官及组织时，限制了手术切除肿瘤的彻底性；手术不能防止肿瘤复发和 转移等。因此手术仅适合于肿瘤范围较局限、没有远处转移、体质好的病人。 1.1.1.2 放射治疗 放射治疗简称放疗，它是利用高能电磁辐射线作用于病变部位，达到破坏癌细胞 目的的一种治疗方法。目前临床上应用的放射线有X线治疗和线治疗两种4。放射治 疗是一种有效的区域性治疗方法。早期的皮肤癌、霍奇金病、鼻咽癌、宫颈癌、喉癌 等单纯放疗也可以达到治愈。但同手术治疗一样，放疗对肿瘤的远处转移也无能为力。 另外，由于放射抗拒、乏氧细胞以及重要器官和组织放射耐受性等因素的影响，放疗 的疗效也受到限制。因此，放射治疗对癌症是否有效，取决于许多因素，如临床时间 的早晚，肿瘤病理类型和它对放射的敏感性，病人的整体状况和肿瘤周围情况等。 基于二氧化硅纳米颗粒的抗肿瘤药物载体研究 2 1.1.1.3 化学治疗 化学治疗是应用一种或数种化学药物，通过口服或注射达到治疗肿瘤的方法。化 学治疗始于 20 世纪 40 年代氮芥治疗淋巴瘤。1965 年，顺铂(DDP)的发现是肿瘤化学 药物历史上的一个里程碑5。随后研发出的许多化疗新药及其临床研究，使肿瘤化疗疗 效得到了提高。化学治疗是目前治疗癌症的主要手段。化学疗法是将药物经血管带到 全身，因为所用药物都是有害，甚至是带毒性的，体内细胞，无论是否为癌细胞，都 受到破坏。这极大地影响了化疗的治疗效果，对患者的身心造成了很大的伤害。提高 化疗效果的关键是如何提高药物的靶向性和降低药物的毒副作用。 1.1.2 抗肿瘤药物载体研究的发展过程 通过载体包裹抗肿瘤药物，能够减少体内酶对抗肿瘤药物的破坏与降解从而提高了 药物在体内的稳定性。同时包裹在载体内的抗肿瘤药物通过缓释过程能够在较长时间 内保持有效的血液浓度，延长药物的作用时间，提高抗肿瘤药物的利用率，降低药物 使用的频率。更为重要的是可以通过在抗肿瘤药物载体上修饰各类靶向分子实现药物 的靶向运输，降低药物的毒副作用。 1.1.2.1 药物载体的发展进程 药物载体的发展可分为几个阶段6。20世纪70年代主要应用的是粒径为5m2mm 的微囊。80年代发展了许多粒径小得多的第二代产品，如110m的微粒。这种粒径的 载药微粒通过非胃肠道给药时，被器官或组织吸收能显著延长药效、降低毒性、提高 活性和生物利用度。90年代至今发展的第三代产品是粒径在10nm500nm的纳米药物载 体。 1.1.2.2 抗肿瘤药物的载体运输对肿瘤治疗带来的新契机 值得注意的是，以往花费巨大的人力、财力筛选成百上千的极有前途的新药落选， 仅仅是因为口服的活性低，注射的半衰期短，如果采用药物包裹技术，通过药物包裹 后采用非胃肠道缓释给药。既不要求口服的活性，也不要求药物本身在体内有长的半 衰期，许多按过去标准认为不合格的落选药物，可能做成满意的新药7。 1.1.2.3 抗肿瘤药物载体产业的发展前景 纳米医药对药释系统已经产生了重大影响，制药公司目前已经意识到药释系统的 研究是他们研发过程中必不可少的一部分。根据一份市场报告（nanoMarket）测算， 到2012年，纳米技术将使药释系统产生48亿美元的收入。另外一份市场报告 （Nanotechnology Law Business）也指出，纳米技术能使药释系统市场的销售额从2005 年的12.5亿美元增至2010年的52.5亿美元，2015年会达到140亿美元。 硕士学位论文 3 1.1.3 纳米抗肿瘤药物载体的优势 近年来纳米技术对药物研究领域的不断渗透和影响，引发了一场深远的革命，特 别是对药物新剂型的研究，由“微米技术”迅速全面地推进到“纳米技术”的深广度8。 运用纳米技术开发的药物克服了传统药物许多缺陷以及无法解决的问题。与传统药物 相比,纳米药物具有颗粒小、比表面积大、表面反应活性高、活性中心多、吸附能力强 等特性9，因此它有许多常规药物所不具有的优点：（1）载药纳米颗粒通过在外壳上 修饰抗体、核酸适体（Aptamer） 、叶酸等生物分子，制成“生物导弹”靶向输药至特 定器官；（2）纳米颗粒具有较为独特的控制释药模式，开始一般表现为相对的爆发释 放，其后在相当长的一段时间内表现为恒定释放，因此，纳米控释制剂可以显著延长 有效血药浓度时限，减少用药和给药次数，减轻毒副作用与患者痛苦，增加患者的依 从性；（3）由于载药纳米颗粒具有粘附性、粒径小，因此，可以延长局部用药药物在 局部组织或部位的滞留时间，增加药物的接触面积，提高口服药物的吸收和生物利用 率；（4）防止药物在输送过程中被体内的消化酶快速降解，提高药物在胃肠道中的稳 定性，提高药物利用率；（5）载药纳米颗粒可以改变膜转运机制，提高药物在生物膜 中的透过性，有利于药物透皮吸收并发挥在细胞内的药效；（6）利用纳米材料的某些 特殊性质还可制成新型的控释药物，如金纳米颗粒在特征光照射下产生热效应，用于 制造热敏控释药物10，利用磁纳米颗粒的磁向导性，靶向病变部位进行热疗11；（7） 现有的抗肿瘤药物大多水溶性差，缺乏特异性，给药后血液浓度波动大，毒副作用较 大，这些都是影响肿瘤临床治疗效果的主要因素。利用纳米颗粒作为载体可对原药进 行改性，增强水溶性或获得靶向性和缓释功能，从而增强肿瘤的治疗效果和降低毒副 作用。 1.2 纳米抗肿瘤药物载体及其应用 理想的纳米药物载体材料应具备以下几方面的性质12：（1）与药物不发生化学反 应；（2）具有较高的载药量和包封率；（3）有适宜的制备及提纯方法；(4)载体材料 生物相容性好，且毒性较低；（5）有一定机械强度和稳定性，具有适当的粒径与粒形； （6）具有较长的体内循环时间。目前，常用的纳米抗肿瘤药物载体主要有脂质体、壳 聚糖、聚合物纳米颗粒和二氧化硅纳米颗粒。 1.2.1 脂质体 1.2.1.1 脂质体的基本介绍 脂质体（liposomes）是一种天然存在或者可以人工制备的自组装胶状颗粒，最先 是20世纪60年代中期英国科学家Bangham和其学生将天然磷脂分散在水中采用电镜观 察时发现的。最初脂质体主要作为人工生物膜用于研究生物膜的结构和功能的关系， 基于二氧化硅纳米颗粒的抗肿瘤药物载体研究 4 20世纪70年代初期，Gregoriadis13首先提出用脂质体作为-半乳糖苷酶载体治疗糖原累 积疾病后，人们开始应用脂质体作为药物载体控制药物释放，水溶性药物包裹与水相 中，而脂溶性药物包裹在脂质双分子层中。 本实验室的郑明彬等14利用脂质体将脂溶性的药物马卡包裹在纳米脂质体内，发 展了一种制备性质良好的马卡制剂的新方法。通过该法制备的马卡纳米制剂包封率高， 胶体溶液物理稳定性良好，冻干粉剂的水再分散性较好，制备过程马卡损失量少，产 物性质优良。李慧敏等15以大豆磷脂、聚乙交酯丙交酯（PLGA）和聚乙二醇（PEG） 三种原料成功制备了包裹难溶于水的植物提取物姜根油的纳米脂质体、PLGA纳米颗粒 和PEG纳米颗粒，并对三种不同载体制备的纳米制剂的形貌、大小、Zeta电位，包封率 及物理稳定性等进行了考察。为开发新型的难溶药用植物提取物的理想药剂提供了实 验依据。胡建兵等16制备了一种TMP1 肽修饰的紫杉醇脂质体颗粒，对其靶向效果进 行了初步研究。其中TMP1 肽链能特异性的识别前列腺癌细胞。考察了这种修饰TMP1 肽的包裹紫杉醇脂质体颗粒的体外、体内的靶向药效。体外的细胞靶向结果说明修饰 TMP1 肽的紫杉醇脂质体颗粒对靶细胞前列腺癌细胞的杀伤明显增强。但是体内的结 果不是非常理想：修饰TMP1 肽的紫杉醇脂质体颗粒与未修饰TMP1 肽的紫杉醇脂质 体颗粒对肿瘤的抑制效果相差无几，但均要明显好于游离紫杉醇。 1.2.1.2 脂质体研究的发展过程 （1）第一代脂质体 药物被天然或人工合成的磷脂以及胆固醇组成的双层膜包封的最基本、最简单的 脂质体结构。主要功能为降低毒性和增加药效。已经上市生产的脂质体药物大部分属 于第一代脂质体。 （2）第二代脂质体 表面用聚乙二醇-磷脂衍生物修饰的脂质体。修饰后的脂质体提高了药物在血液中 的循环时间，增加了药物的被动靶向功能。聚乙二醇-脂质体阿霉素（Doxil）已经通过 美国食品药品监督管理局（FDA）认证，上市生产。多种聚乙二醇-脂质体也已进入临 床/期阶段。 （3）第三代脂质体 脂质体表面修饰聚乙二醇（PEG）并在聚乙二醇终端引入靶向基团，这些靶向基 团可以是单克隆抗体、多糖、叶酸、维生素B12和多肽。这类脂质体药物已经进入临床 /期阶段。 （4）第四代脂质体 通过修饰使脂质体具有靶向性、可控释放性、pH敏感性及其他可控性能，从而提 高药效。这类脂质体具有一定可控性故称智能脂质体。目前第四代脂质体还处于实验 室研究阶段。 硕士学位论文 5 1.2.1.3 脂质体药物载体的应用实例 脂质体以其良好的生物相容性和简便的制备方法在药物载体领域得到了广泛的应 用。并且有部分药物-脂质体产品已经得到 FDA 批准上市，包括脂质体阿霉素 （Doxil）17、脂质体两性霉素（AmBisome） 、脂质体柔红霉素（DaunoXome） 、脂质 体阿糖胞苷（DepoCyt）、脂质体吗啡（DepoDur）以及新型光敏剂脂质体维替泊芬 （Visudyne）18-19。但是脂质体作为药物载体有两个缺陷导致其在这方面的应用受 阻：（1）脂质体的不稳定，由于脂质体为双层磷脂通过亲疏水力聚合而成，在体 内蛋白质和酶的作用下包裹药物的脂质体通常在达到作用位点之前就已破碎，提前 释放出所装载药物，达不到定点释放的效果；（2）缺少一种可控的机制来调控包 裹在脂质体内的药物释放。针对以上两点，近年来研究人员做出了大量努力。 （1）提高脂质体稳定性研究 Bégu等20在脂质体表面通过溶胶-凝胶法包裹上一层无定形的硅壳，制备出了一种 称为脂质体硅(Liposil)的载体(图1.1)。Bégu等21详细地考察了Liposil的性质，结果表明 包裹硅壳后脂质体的稳定性有极大地提高。由于硅壳是多孔结构，小分子和水能够自 由地通过，包裹在硅壳内的脂质体具有未包裹脂质体一样的结构和动力学性质。并且 能够同时装载亲水和疏水两种性质的药物。随后Bégu等22以羧基荧光素作为模式药物 考察Liposil作为药物缓释载体的应用。pH为1.2的条件下，Liposil能够稳定存在并且硅 壳对脂质体提供保护。pH为7.4硅壳被水解，不能对脂质体提供保护，释放出羧基荧光 素。Liposil虽然有很好的稳定性但是颗粒的分散性不好，影响了其作为药物载体的应 用。Avnir等23将聚乙二醇化(PEG)的脂质体作为模板制备Liposil，由于PEG长链的存在， 颗粒的分散性有所提高。 Frisch等24在脂质体表面包裹聚合物制备了一种称为Layersome的药物载体。在脂 质体表面包裹的聚合物层同样提高了脂质体的稳定性。聚合物层采用层层自组装的方 式包裹，带正电的聚赖氨酸(pLL)和带负电的聚谷氨酸(pGA)交替包裹在小单层脂质体 表面，Layersome的粒径可由包裹的层数来控制，而电位可由包裹在最外层的聚合物所 带电荷来确定。作者将Layersome置于表面活性剂曲拉通和极性溶剂乙醇的极端条件下， Layersome均能稳定存在。 图 1.1 二氧化硅壳包裹的脂质体的透射电镜图20 基于二氧化硅纳米颗粒的抗肿瘤药物载体研究 6 a b 图 1.2 原酸酯类磷脂的结构示意图(a)及酸性条件下缓慢分布降解的过程(b)25 （2）脂质体的pH触发释放研究 感染部位、原发或转移肿瘤的pH相对于正常组织的pH一般更低。pH敏感脂质体就 是利用这一特点选择性地在病变部位破裂、融合，定点释放药物。从而减少了对正常 细胞的影响，降低了药物的毒副作用。实现脂质体的pH敏感一般可通过两种途径： 第一种，在脂质体内掺入pH敏感的磷脂，其作用机理是：在酸性的情况下，pH敏 感脂质体中的脂肪酯羧基质子化形成六角方晶相，磷脂之间的间距增大，脂质体变得 不稳定，从而将包封的物质释放出来。传统的pH敏感磷脂是二油酰磷脂酰乙醇胺 （DOPE） 。若要形成稳定的脂质体还应加入含有酸性基团的物质，如油酸(OA)、半琥 珀酸胆固醇(CHEMS)等。但是在中性条件下传统pH敏感磷脂仍然带有负电荷，容易与 体内的血清蛋白及巨噬细胞作用，使其迅速被网状内皮系统（RES）清理出体外。 Szoka等25-26合成了原酸酯类磷脂，作者将亲水性的头与疏水性的尾分别与多元酸酯在 无水条件下缩合形成类磷脂的化合物原酸酯类磷脂(POD)（图1.2a） ，这种化合物与磷 脂一样也可以形成脂质体包裹抗肿瘤药物。不同的是这种原酸酯类脂质体在碱性和中 性的条件下更加稳定在体内不容易提前释放出所装载药物，并且对pH的响应更准确。 如图1.2b原酸酯类脂质体在酸性条件下是逐步水解，药物的缓释相对较平稳。 第二种，在磷脂双层中插入融合蛋白或其他pH敏感的聚合物。如图1.3所示，Lee 等27发展了一种可以广泛应用的脂质体上的pH调控机制。作者在具有pH敏感的聚合物 聚异丙基丙烯酰胺上修饰胆固醇分子，利用胆固醇将pH敏感的聚合物插入脂质体中。 中性条件下，聚合物分子之间相互交联增强了脂质体的稳定性；酸性条件，聚合物分 子之间的连接断开，脂质体稳定性下降。 图 1.3 聚合物修饰在脂质体表面实现 pH 调控的示意图27 硕士学位论文 7 1.2.2 壳聚糖 壳聚糖（Chitosan）是天然资源甲壳素脱乙酸化后得到的一种天然聚阳离子多糖， 可溶于酸或酸性溶液，无毒、无免疫原性，在体内能被溶菌酶等酶解，具有优良的生 物降解性和成膜性，在体内可溶胀成水凝胶28。壳聚糖毒性低，可生物分解，能降低 血脂、血沉及血小板粘附，可加快伤口愈合等。因此是一种良好的药物载体材料29。 壳聚糖分子链上丰富的羟基和氨基，使其易于进行化学修饰而赋予多种功能。 1.2.2.1 壳聚糖的基本介绍 影响壳聚糖纳米颗粒药物释放速率的因素30：（1）药物的含量，壳聚糖中所含药 物量越少、药物被包裹得越紧密，药物的释放速率就越低；（2）交联度，壳聚糖的交 联越多，即增加交联剂的用量或延长交联时间，形成的壳聚糖膜或胶囊就越紧密，药 物的释放速率越低；（3）壳聚糖的分子量，在交联度及脱乙酰度一定的情况下，壳聚 糖分子量大，形成的网络就较不紧密，有利于药物的释放；（4）壳聚糖的脱乙酰度， 对于极性分子药物，与壳聚糖之间会产生一定的结合力，壳聚糖脱乙酰越大，对极性 药物分子的结合力越大，当脱乙酰度超过90%，药物的释放速率就没有太大的变化。 （5）粒度或膜厚，对于颗粒缓释药物，颗粒越小，表面积越大，相对而言药物的释放 速率就越大；壳聚糖膜越厚，药物越不容易释放出来。 （6）释放环境的pH值，壳聚糖 在pH3.5的溶液中在0.5h内变为絮状，在pH4.0的缓冲溶液中在1h内则能溶解 10%70%，而在pH5的介质中，膜的溶解缓慢。例如在胃中，因是酸性环境，壳聚糖 容易溶胀、溶解，即使是交联过的也会发生这种作用，只是程度小一点或慢一点。 （7）溶菌酶的影响，溶菌酶能降解壳聚糖，因此研究壳聚糖在体内的药物释放速率还 应该考虑这个因素。 1.2.2.2 壳聚糖药物载体的应用实例 肿瘤细胞表面的负电荷比正常细胞表面更多，壳聚糖表面富含氨基，使其带正电 荷，从而容易吸附到肿瘤细胞表面，使肿瘤细胞难以从肿瘤组织上脱离，能够抑制肿 基于二氧化硅纳米颗粒的抗肿瘤药物载体研究 8 瘤的转移31。 壳聚糖还有直接抑制肿瘤细胞生长的作用，杜昱光等32研究了几种低分子量壳聚 糖对S180癌细胞的抑制作用,并对不同工艺制备的壳聚糖进行了抑瘤活性的比较，结果 表明：其中一种对癌细胞DNA合成的抑制作用效果最好，抑制率达98.5，高于顺铂 组及对照组。 Mitra等33用壳聚糖包裹阿霉素与葡聚糖的交联物，制成可生物降解、生物相容性 良好的纳米颗粒。此种颗粒的直径在(100±10)nm，对肿瘤组织有良好的靶向性，不仅 降低了阿霉素的毒副作用，同时也增强了治疗效果。 Yataka等34观察了抗癌药顺氯氨铂-壳聚糖纳米颗粒的释放特性及壳聚糖掺入的影 响。指出顺氯氨铂的释放率包封率随壳聚糖胺浓度增加而增大，壳聚糖的掺入对初速 破裂有抑制作用，顺氯氨铂的释放率随壳聚糖增多而减少，壳聚糖浓度从1提高到 5时，释放半衰期由0.5h延长到4.5h。另外，用磺化琥铂酸二辛酯作为稳定剂，通过 戊二醛交联得交联壳聚糖纳米颗粒，交联度不同颗粒膨胀度亦随之变化。体外测定释 放曲线，表明该壳聚糖纳米颗粒有非常理想的控制作用。 本实验室的郑明彬等35以壳聚糖作为载体发展了一种制备物理性质良好的甲氨蝶 呤纳米制剂。制备得到的包裹甲氨蝶呤的壳聚糖纳米颗粒大小均匀、分散性好、性质 稳定，包封率高，并且缓释效果良好。体外的抗肿瘤活性实验表明甲氨蝶呤被壳聚糖 包裹后仍然保持了较好的抗癌活性。吴萍等36采用基于壳聚糖与聚阴离子(多聚磷酸纳) 间静电作用的离子凝胶化方法，以牛血清白蛋白(BSA)为模型，在室温下制备了包载蛋 白质的亲水性壳聚糖纳米颗粒。并将该体系初步应用于蛋白类药物丙种球蛋白-壳聚糖 纳米颗粒的制备研究，这种壳聚糖纳米颗粒对丙种球蛋白具有良好的缓释作用。彭姣 凤等37发展了一种简单易行的方法来制备与改善壳聚糖-DNA颗粒的性能，通过在壳聚 糖与DNA反应体系中加入不同大小与荷电数的阴离子，利用壳聚糖与DNA之间以及壳 聚糖与各阴离子之间的静电吸引协同作用，控制壳聚糖的可控凝胶化，溶液中的极性 阴离子也打破了存在于纳米颗粒之间的氢键、疏水作用力，制备出了大小均匀、分散 性好的壳聚糖-DNA纳米颗粒。 1.2.3 聚合物颗粒 1.2.3.1 聚合物颗粒的分类 1.聚合物纳米颗粒 聚合物纳米颗粒（Ploymer）相比于天然材料纳米颗粒的一大优势是：采用其制备 的纳米颗粒对包载的药物具有更长时间的缓释能力（数天至数周） 。聚丙交酯 PLA 和 PLGA 是两类研究得最透彻的材料。其中 PLGA 以其良好的生物相容性和生物降解性 成为制药领域最常用的材料，并且被 FDA 批准用于人体。这种聚酯进入人体组织后发 生水解，形成可代谢的片段，如乳酸和乙醇酸和乳酸，而这些片段最终会通过柠檬酸 硕士学位论文 9 循环从体内排除。 2.树枝状聚合物 树枝状聚合物（Dendrimer）是一大类复杂的高度分支状聚合大分子，化学结构明 确且表现为反分散性。它通过向中心核连续加重复单元而形成单分散的球形分子，表 现出具有呈高度支化的树枝状的几何外观。树枝状聚合物的结构主要包括三个的部分： 最内层合成树枝形分子多官能团的核心(C)，中间分支的重复单元(B)和最外层的表面活 性官能团(S)。这些从核心开始到最外层之间一层层分支的重复单元组成了一系列向外 发散的同心圈层，被定义为树枝形分子的代数。通常我们定义核心为第0代，由核心向 外的每层重复单元依次定义为第l，2，3，n代。 树枝状聚合物最早是由美国人D. A. Tomalia博士于20世纪80年代初合成成功的。它 的粒径为10130nm。合成树枝状聚合物通常使用的聚合物如聚酰胺（PAMAM） ，它是 通过分散法由氨或乙二胺作为内核引发合成得到的。此后树枝状聚合物的研究和应用 得到不断发展，并应用到了药物载体领域。 树枝状聚合物的合成方法有两种： （1）发散合成法，以一个中央分子，如氨、乙二胺、丙胺或三羧酸氯苯等为核心 向四周生长、发散，通过逐步聚合反应，向外生长、加层，最终形成树枝状聚合物。 每循环一次产生一代，记做G0，G1，G2等等。合成的步骤决定代数（Generation）和体 积。由于树枝状聚合物表面发散生长致密压缩形成的空间位阻效应可抑制自身生长， 故经过循环反应最多只能达到10代。低代数（G0G4）树枝状聚合物呈平面状椭球型， 高代数（G5G10）由于树枝状压缩结构呈球型。 （2）收敛合成法，会聚法与发散法生长方向相反，从分子的外部开始单体联接形 成树枝状的结构块，通过多次激活和单体联接结构块逐渐增大，最后连接到多功能基 的核上得到球形的树枝状聚合物。会聚法每一次激活和联接反应中反应部位比发散法 要少得多。 3.聚合物胶束 聚合物胶束（Polymeric micelles）系指一类由两亲性嵌段共聚物组成的胶束，该两 亲共聚物由疏水片段和亲水片段组成，并且亲水片段体积一般大于疏水片段，可在水 中自发排列成核壳型结构，疏水片段形成胶束内核，亲水片段形成胶束外壳。药剂学 用于增溶难溶药物的低分子表面活性剂不是增溶效果不理想，就是具有较大毒性。作 为一种新型的载体，聚合物胶束基本克服了以上缺点，且载药范围广、结构稳定、具 有优良的组织渗透性，体内滞留时间长，能使药物有效地到达靶点。而且它具有较低 的临界胶束浓度（CMC） ，在体循环中较为稳定。 1.2.3.2 聚合物颗粒药物载体的应用实例 1.聚合物纳米颗粒药物载体的应用实例 基于二氧化硅纳米颗粒的抗肿瘤药物载体研究 10 2004年，Farokhzad等38将氨基化RNA核酸适体修饰到羧基化/聚乙二醇化乳酸-羟 基乙酸共聚物纳米颗粒(PLGAbPEGCOOH) 表面，药物分子则包裹在疏水的聚合物 颗粒内，实现了细胞水平上药物的靶向运输（如图1.4所示） 。2006年，Farokhzad等39 继续考察了核酸适体修饰的包裹紫衫醇聚乙二醇化乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒 （Dtxl-NP-Apt）在活体水平上的靶向药物运输能力。结果表明：在活体内Dtxl-NP-Apt 相对未修饰核酸适体的包裹紫衫醇聚乙二醇化乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒（Dtxl- NP）毒性明显减少，注射Dtxl-NP-Apt的裸鼠体重减少量（BWL）为7.7±4%，而注射 Dtxl-NP的裸鼠BWL为18±5%。在种了瘤的七只裸鼠中，注射Dtxl-NP-Apt组有五只肿 瘤明显减小并且100%存活了109天，注射Dtxl-NP组有两只肿瘤明显减小并且57%存活 了109天，而Dtxl组存活率仅为14%。进一步在活体水平上证实核酸适体修饰的聚合物 纳米颗粒毒性减小，靶向运输能力增加。随后，Farokhzad等40通过控制：(1)聚合物加 入的浓度；(2) 药物装载量；(3) 溶剂的水溶性；(4) 水和溶剂加入的比值来调节羧基 化聚乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇颗粒（PLGAbPEGCOOH）的大小。发现聚合物加入 的浓度与聚合物颗粒直径在70250nm呈线性相关。作者将具有靶向功能的核酸适体 A10 PSMA连接到聚合物纳米颗粒表面，发现显著提高了颗粒在活体内的靶向性。 图 1.5 精确控制修饰在聚乙二醇化乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒表 面的核酸适体数量的示意图41 图 1.6 脂质包裹聚合物纳米颗粒的制备和表征42 (a)：将阿霉素共价修饰到聚乳酸-羟基乙酸共聚物分子上的示意图；(b)：聚合物纳 米颗粒的扫描电镜图；(c)：将抗血管坏死因子包裹在外层脂质体中；(d)：脂质包裹 聚合物纳米颗粒的透射电镜图；(e)：脂质包裹前后聚合物颗粒的粒径变化；(f)：抗 血管坏死因子与阿霉素的释放情况 图 1.4 氨基化的核酸适体 A10 PSMA 修饰到羧基化/聚乙二醇化乳酸-羟基乙酸共聚物 纳米颗粒表面的示意图38 硕士学位论文 11 在聚合物颗粒表面修饰核酸适体一般是先制备好聚乙二醇化乳酸-羟基乙酸共聚物 纳米颗粒，然后再进一步修饰。这就为量化控制颗粒表面核酸适体的数目带来了困难。 2008年，Farokhzad等41则改进了颗粒制备与修饰的方法：作者通过先合成连接有核酸 适体的聚乙二醇化乳酸-羟基乙酸共聚物片段，然后通过加入未修饰核酸适体的聚乙二 醇化乳酸-羟基乙酸双嵌段共聚物与已修饰核酸适体的聚乙二醇化乳酸-羟基乙酸三嵌段 共聚物之比(PLGA-b-PEG DCP:PLGA-b-PEG -b-Apt TCP)来精确调控聚合物颗粒表面核 酸适体的数目（图1.5） 。详细的研究了在聚乙二醇化乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒表 面修饰的核酸适体的量对颗粒在活体内靶向性能的影响，并优化了一个最佳的核酸适 体修饰浓度。为聚乙二醇化乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒在药物靶向运输领域的应用 提供了很好的基础。 Sengupta等42在聚合物纳米颗粒表面包裹脂质体，并利用这种结构将具有互补功能的 抗肿瘤药物阿霉素和抗血管坏死因子分别包裹在内层聚合物颗粒内和外层磷脂中（图 1.6） 。包裹在外层磷脂中的抗血管坏死因子首先释放，阻止肿瘤组织内部的毛细血管坏 死，维持抗肿瘤药物运输通道；包裹在内层聚合物颗粒内的抗肿瘤药物阿霉素随后释 放，通过毛细血管到达肿瘤组织深处。这种组合的载药方式极大地提高了肿瘤杀伤的 效果。 2. 树枝状聚合物药物载体的应用实例 基于二氧化硅纳米颗粒的抗肿瘤药物载体研究 12 Lin等43将树枝状聚合物分子PAMAM与介孔二氧化硅纳米颗粒结合起来应用到药 物的控制释放载体领域。作者将PAMAM修饰到介孔二氧化硅纳米颗粒的孔口，在生理 条件下这种连接非常稳定，树枝状聚合物分子PAMAM堵住包裹在二氧化硅纳米颗粒内 的药物分子。当载药体系到达作用部位，加入触发分子还原剂后，PAMAM与介孔二氧 化硅纳米颗粒的连接键被还原而打开，PAMAM从介孔二氧化硅纳米颗粒孔口脱落，包 裹在介孔二氧化硅纳米颗粒内的药物分子则可自由地扩散出来。由于PAMAM会在颗粒 表面形成一层致密的聚合物层，还原剂触发分子要首先通过这层物质才能使“盖子” 脱落。随着触发分子的陆续到达，PAMAM“盖子”才逐渐脱落，所以药物分子更加缓 慢与平稳的释放。随后，Lin等44使用修饰有低代数（G=2）树枝状聚合物分子 PAMAM的介孔二氧化硅纳米颗粒实现了转基因和药物的双转运（如图1.7） 。同样，作 者将PAMAM分子修饰在介孔二氧化硅纳米颗粒的孔口作为“盖子” ，将药物分子封装 在介孔二氧化硅纳米颗粒的孔内。不同的是作者同时利用正负电荷的吸引作用将带负 电的DNA分子吸附在带正电荷的PAMAM分子表面。实现了模式药物texas red染料和绿 色荧光蛋白基因的共转运。并且缠绕在介孔二氧化硅纳米颗粒表面的DNA可以有效的 避免被核酸内切酶的降解，提高了基因转染的效率。 3.聚合物胶束药物载体的应用实例 如图1.8所示，Huo等45在丙二醇与环氧乙烷聚合物（PEO）胶束表面加上了硅层， 形成了一种新型的胶束-硅核-壳型的纳米颗粒，其优点就是显著地提高了聚合物胶束的 稳定性，在浓度不断稀释的情况下也不会破碎。硅网致密的结构还能够有效地减慢药 物释放的速率。并且利用硅材料表面易修饰的性质，通过修饰功能基团可以更进一步 的延长药物的释放时间。 图1.8 二氧化硅壳包裹的聚合物胶束纳米颗粒示意图以及透射电镜图45 图 1.7 树枝状聚合物分子 PAMAM 修饰到介孔二氧化硅纳米颗粒孔口实 现药物的控制释放与转基因双功能的示意图44 硕士学位论文 13 1.2.4 二氧化硅纳米颗粒 二氧化硅纳米颗粒是以硅烷化试剂在催化剂的催化下相互缩聚形成三维网状结构。 它具有无毒、生物相容性好、稳定性高、表面易修饰等特点。 1.2.4.1 二氧化硅纳米颗粒药物载体的分类 1.介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs) 1992年，日本Mobil公司的研究人员46用表面活性剂液晶模板法合成出了结晶硅酸 盐/硅铝酸盐介孔分子筛系列材料(图1.9), 该系列材料包括六方状的MCM-41、立方状的 MCM -48 和片层状的MCM -50。国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)定义：孔径小于2 nm为微孔；250 nm为介孔；大于50 nm为大孔。故这种二氧化硅纳米颗粒被称为介 孔二氧化硅纳米颗粒。用作药物运输载体主要为球形MCM-41型介孔二氧化硅纳米颗粒。